[发明专利]一种直接识别3-氨基-5-吗啉甲基-2-恶唑烷酮的单链抗体及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了一种直接识别3‑氨基‑5‑吗啉甲基‑2‑恶唑烷酮（AMOZ）的单链抗体（scFv）及其制备方法和应用。所述单链抗体包括重链可变区和轻链可变区，其序列分别如SEQ ID NO.1和2所示，或与所示序列经缺失、取代或添加一个或多个氨基酸但与所示序列具有相同功能的氨基酸序列。本发明提供的单链抗体scFv与抗原的结合可被游离的半抗原竞争性抑制，IC₅₀为72.93ng/mL，检测限为13.35ng/mL，具有很好的抗原结合活性；通过标准曲线可知线性检测范围分别在24.98～212.92ng/mL之间。该基因工程抗体在AMOZ的免疫检测和大量样品的快速检测筛选方面具有很好的应用前景。

技术领域

本发明属于食品安全检测技术领域。更具体地，涉及一种直接识别3-氨基-5- 吗啉甲基-2-恶唑烷酮(AMOZ)的单链抗体(scFv)及其制备方法和应用。

背景技术

3-氨基-5-吗啉甲基-2-恶唑烷酮(AMOZ)是硝基呋喃类抗生素呋喃它酮的体内代谢产物。呋喃它酮被动物服用后，原药分子在动物体内迅速代谢，其在体内的稳定性不超过几小时，但其代谢产物AMOZ与细胞膜蛋白结合成为结合态，能够在体内长期保持稳定，从而延缓了原药在体内的清除速度。而普通的食品加工方法(如烧烤、微波加工、烹调等)难以使结合态AMOZ残留物大量降解，食用含有该残留物的肉制品会对人体产生一定的毒副作用。研究表明：蛋白结合态的AMOZ残留物含有AMOZ的完整侧链，在人胃的弱酸条件下，侧链可以从蛋白质中释放出来被人体吸收，进而对人类健康造成危害，产生致癌、致突变毒性。鉴于此，目前国内外很多国家都对呋喃它酮进行严格控制，在食用动物生产中相继将其列为违禁药物，如澳大利亚(1993)、美国(2000)、菲律宾(2001)、巴西(2002)、泰国(2002)、中国(2002)等。考虑到其原药分子的代谢特性，目前一般通过测定AMOZ的残留量来实现对呋喃它酮的监控。欧盟(EU)于2003 年通过了2003/181/EC委员会决议，规定用于禽肉产品和水产品中AMOZ各种检测方法的检出限性能要求(minimum required performance limits，MRPL)为1 μg/kg。

然而，目前在很多国家，尤其是发展中国家中，呋喃它酮的非法使用现象仍旧存在。在我国AMOZ是农业部在畜禽及蜂产品兽药残留监控检测中必检的指标，而且在近三年(2011～2014年)的抽检过程中AMOZ仍时有检出，因此建立并优化AMOZ的检测方法十分必要。

目前已报道的AMOZ测定方法主要包括仪器分析方法和免疫学分析方法。其中，前者主要包括高效液相色谱法(HPLC)、液相色谱-质谱法(LC-MS)和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)，后者主要包括酶联免疫分析法(ELISA) 和胶体金免疫层析法(ICA)。仪器分析方法具有稳定性好、灵敏度高等优点，在微量或超微量分析中占有权威性地位。但由于该方法需要大型昂贵的仪器设备及专业的操作人员，加之样品前处理繁琐费时、检测成本高，难以满足高通量、快速检测的需要。而基于抗原-抗体识别的免疫分析技术具有快速、灵敏、准确、可实现现场高通量筛查等优点，在小分子化学性污染物检测领域占有重要地位，已经成功应用于农药、兽药、生物毒素等的快速检测，为保障食品安全发挥了重要作用，被称为是21世纪最具竞争力和挑战的超微量检测技术。但由于AMOZ 分子量太小，高质量抗体制备一直未取得突破，因而目前大多是基于衍生化建立的间接免疫检测方法，常用的衍生剂是硝基苯甲醛。衍生策略虽然可以实现对 AMOZ的免疫检测，但在检测前需对其进行衍生化处理，操作复杂耗时，成本高，且通常回收率偏低，应用起来非常不便。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有3-氨基-5-吗啉甲基-2-恶唑烷酮 (AMOZ)检测技术的缺陷和不足，提供一种可直接识别AMOZ的单链抗体 (Single-chain antibody)。

本发明的目的是提供一种直接识别3-氨基-5-吗啉甲基-2-恶唑烷酮(AMOZ) 的单链抗体(scFv)。

本发明另一目的是提供所述单链抗体(scFv)的制备方法。