[发明专利]一种用于分析肠道微生物的试剂盒及其应用

说明书

技术领域

本发明属于分子生物学领域，涉及一种用于分析肠道微生物的试剂盒及其应用，具体涉及通过两轮PCR构建文库，包括分析分类肠道微生物的引物组合物的试剂盒及应用。

背景技术

动物胃肠道内庞大多样的微生物群落与动物的食性、机体的免疫功能、疾病与健康等有着密切联系，越来越引起重视并成为研究热点。然而采用传统方法破环性的采集胃肠道样品对其进行研究受到很大制约，且对于野生保护动物并不可取，因此很多研究都以动物的粪便作为研究样品。

科学家们还发现，不同国家人群中的肠道微生物存在很多差异，差异最显著的是微生物的多样性程度。例如：印第安人和马拉维人的肠道微生物组比美国人的肠道微生物具有更大的多样性。有观点认为，微生物多样性程度越高，人体越健康。该研究还发现，尽管来自三种不同地域人群的肠道微生物组存在很多差异，但它们之间也存在惊人的相似性。如，三个不同国家的婴儿微生物组形成过程具有共同的模式，即婴儿需要6-9个月的时间来获得第一组6-700个细菌，然后再经过几年的时间才能获得成人的微生物组。该研究还发现了一个非常有趣的现象，即肠道微生物组的构成会随年龄增长而发生改变，而这一变化恰恰适应了不同年龄段人体的需求。

肠道微生物的研究大体经历了培养依赖的方法，非培养依赖的传统分子生物学方法，基于测序的高通量组学方法3个阶段。

通过比较3个阶段研究方法的特点与应用，人们可以发现培养依赖的方法在鉴定菌种的同时即可获得相应菌株，方便后续研究，但培养法本身费时费力，肠道微生物以厌氧菌和兼性厌氧菌为主，培养起来更加困难，并且在培养的过程中菌种比例会发生改变，使得其应用存在瓶颈。非培养依赖的传统分子生物学方法可以不经培养直接从样品中提取肠道微生物基因组，利用分子生物学手段进行分离、鉴定和定量，使其结果可以比较准确的反应肠道微生物中高丰度菌种的组成和真实比例。

但是传统分子生物学方法存在着通量低的缺陷，靶向方法如实时定量PCR每次只能研究一种或一类肠道微生物，而非靶向方法如最常用的梯度变形凝胶电泳(Denaturinggradient gel electrophoresis，DGGE)受限于灵敏度，往往只能研究肠道中高丰度的微生物。肠道微生物群落组成复杂，每种细菌都与其他细菌形成复杂的相互关系网络，低丰度的菌种同样扮演者重要的角色，所以传统分子生物学研究结果往往具有片面性。

16SrDNA因其序列在物种间的高度多样性，成为细菌分类学研究的“分子钟”，具9个可变区和10个保守区间隔排列的特征，可变区因细菌而异，且变异程度与细菌的系统发育密切相关。因此通过分析可变区的序列即可得到各细菌的分类学特征。

CN 105937053 A公开了一种基于高通量基因测序建立粪便菌群基因文库的方法，该方法采用“巢式PCR”的方法对以16S rDNA进行富集扩增，最大限度减少了宿主和食物残渣基因组污染，同时将V3和V6组合，进行特异扩增并进行大规模并行测序，获得菌群的靶标基因序列库。CN 107058490 A公开了一种基于新一代高通量测序技术的肠道及口腔菌群多样性及差异性的分析方法，该方法利用illumina MiSeq测序系统进行测序，从而分析菌群的组成与功能。但构建的文库覆盖率不够高，检测灵敏度较低。

基于上述问题，如何设计引物，能够尽可能全面覆盖所述样本的微生物，提高检测的特异性和灵敏度，就成为亟待解决的问题。

发明内容

针对现有技术的不足，本发明提供了一种分析肠道微生物的试剂盒及其应用，本发明引物组合物采用两步法扩增获得测序文库，其中包含了1-7bp的随机碱基序列，增加了文库序列的复杂度，降低了phix的比例，保证更多测序质量，提高了文库的覆盖度。

第一方面，本发明提供了一种用于分析肠道微生物的试剂盒，其包含用于构建肠道微生物文库的引物组合物，所述引物组合物包括两组引物，具体如下：

第一组引物，所述第一组引物包含第一正向引物和第一反向引物，其中，所述第一正向引物从5’到3’端包括依次相连的三个部分：第一测序通用引物、1-7bp的随机碱基序列和肠道微生物16S rRNA V3-V4区特异性正向引物；所述第一反向引物从5’到3’端包括依次相连的三个部分：第二测序通用引物、1-7bp的随机碱基序列和肠道微生物16S rRNA V3-V4区特异性反向引物；