[发明专利]一种用于分析肠道微生物的试剂盒及其应用

权利要求书

1.一种用于分析肠道微生物的试剂盒，其包含用于构建肠道微生物文库的引物组合物，所述引物组合物包括两组引物，具体如下：

第一组引物，所述第一组引物包含第一正向引物和第一反向引物，其中，所述第一正向引物从5’到3’端包括依次相连的三个部分：第一测序通用引物、1-7bp的随机碱基序列和肠道微生物16S rRNA V3-V4区特异性正向引物；所述第一反向引物从5’到3’端包括依次相连的三个部分：第二测序通用引物、1-7bp的随机碱基序列和肠道微生物16S rRNA V3-V4区特异性反向引物；

第二组引物，所述第二组引物包含第二正向引物和第二反向引物，其中，所述第二正向引物从5’到3’端包括依次相连的三个部分：P5端接头序列、第一标签序列和第一测序通用引物的部分序列；所述第二反向引物从5’到3’端包括依次相连的三个部分：P7端接头序列、第二标签序列和第二测序通用引物的部分序列。

2.根据权利要求1所述的试剂盒，其特征在于，所述第一测序通用引物和所述第二测序通用引物独立地选自任意一种二代测序平台的测序通用引物；

优选地，所述第一测序通用引物的核酸序列如SEQ ID NO.1所示，所述第二测序通用引物的核酸序列如SEQ ID NO.2所示；

优选地，所述随机碱基的碱基个数为3-5个；

优选地，所述肠道微生物16S rRNA V3-V4区特异性正向引物的核酸序列如SEQ ID NO.3所示，所述肠道微生物16S rRNA V3-V4区特异性反向引物的核酸序列如SEQ ID NO.4所示。

3.根据权利要求1或2所述的试剂盒，其特征在于，所述P5端接头序列的核酸序列如SEQ ID NO.5所示，所述P7端接头序列的核酸序列如SEQ ID NO.6所示；

优选地，所述第一标签序列如SEQ ID NO.7-16所示，所述第二标签序列如SEQ ID NO.17-26所示；

优选地，所述第一测序通用引物的部分序列如SEQ ID NO.27所示，所述第二测序通用引物的部分序列如SEQ ID NO.28所示。

4.一种肠道微生物的分析方法，其特征在于，采用如权利要求1-3中任一项所述的试剂盒，包括如下步骤：

(1)样本基因组DNA的提取；

(2)扩增子文库的构建：进行两轮PCR扩增，第一轮PCR扩增采用第一组引物组，第二轮PCR扩增采用第二组引物组，构建高通量测序文库；

(3)数据分析。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述样本来源于粪便、土壤、尿液或唾液中的任意一种或至少两种的组合，优选为来源于粪便。

6.根据权利要求4或5所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述第一轮PCR的条件为：93-96℃预变性1-5min；93-96℃预变性20-40s，50-55℃20-40s，70-75℃20-40s，共进行25-35个循环；70-75℃延伸3-6min；

优选地，步骤(2)所述第一轮PCR的条件为：95℃预变性3min；95℃预变性30s，53℃30s，72℃30s，共进行28个循环；72℃延伸5min；

优选地，步骤(2)所述第二轮PCR的条件为：93-96℃预变性1-5min；93-96℃预变性20-40s，54-58℃20-40s，70-75℃20-40s，共进行6-12个循环；70-75℃延伸3-6min；

优选地，步骤(2)所述第二轮PCR的条件为：95℃预变性3min；95℃预变性30s，55.5℃延伸30s，72℃30s，8个循环；72℃5min，1个循环。

7.根据权利要求4-6中任一项所述的方法，其特征在于，步骤(2)所述第一轮PCR之后还包括纯化的步骤，优选采用磁珠进行纯化；

优选地，所述磁珠与扩增产物的体积比为(0.4-0.7):1，优选为0.5:1；

优选地，步骤(2)所述第二轮PCR之后还包括纯化的步骤，优选采用磁珠进行纯化；

优选地，所述磁珠与扩增产物的体积比为(0.7-1.1):1，优选为0.9:1。