[发明专利]一种远程采样水稻籽粒碳代谢关键酶活性检测方法

说明书

本申请公开了一种远程采样水稻籽粒碳代谢关键酶活性检测方法，采用液氮保存、保温瓶运输，实验室籽粒带壳磨样、改进方法检测、数据还原；本申请方法能提高远距离水稻分子酶活测定研究的准确性和精度；由于采取了籽粒带壳测定酶活性，适用于碳代谢和氮代谢酶活检测的采样，使灌溉机理实验不再局限于近距离取样；拓展了远距离试验区的研究，应用前景较广。

技术领域

本申请属于农业生物技术领域，尤其涉及一种远程采样水稻籽粒碳代谢关键酶活性检测方法。

背景技术

水稻籽粒中淀粉含量约占90%，水稻籽粒充实的过程就是淀粉积累的过程。因此，淀粉在籽粒积累的速度和持续时间，决定了籽粒充实的优劣和籽粒的重量。水稻碳代谢是最基础的代谢,直接关系到水稻的产量与品质。

在淀粉生物合成、优质水稻品种选育和品质遗传改良研究中，通常要测定水稻碳代谢关键酶的活性。近年来的研究表明，无论是高等植物的光合器官还是非光合器官，ADPG焦磷酸化酶(ADPglucose pyrophosphorylase,EC 2 . 7 . 7 . 21, AGPP)和淀粉合成酶( Starch syn-thane , EC 2 . 4 .1. 21, SSS)及淀粉分支酶( tarchbranchingenzyme, EC 2.4.1.18,SBE)是籽粒淀粉合成代谢的几个关键酶，对水稻籽粒中淀粉合成和积累起着重要的调节作用。

常规采用以下方法取样测定碳代谢酶活性：在抽穗期，各小区选取生长整齐一致且同日抽穗的稻穗挂牌标记，自抽穗第10天起，测试抽穗后每5天的碳代谢酶活性，该取样时间能够确定水稻籽粒充实过程的分子酶活性变化规律。每次于上午9:00一9:30取标记穗，迅速装入冻存管用液氮冷冻处理后，运输至目的地后保存于-20℃冰柜中。待测定样品时，每穗上只选取灌浆基本一致的穗中部充实粒用于酶活性测定，以消除开花时间的差异所带来的误差，粗酶液的提取取样品籽粒30粒，去壳去胚，称重。在预冻的研钵中研磨，提取介质为：10mL缓冲液0.1 Mol / L1mL研磨、3次3mL冲洗(体系为： Hepes-NaOH(pH 7.6)，5mmol / L MgC1₂，5mmol/ L DTT（二硫苏糖醇），2 % (W / V)PVP（聚乙烯比咯烷酮）)，研磨液在10 000r/min下冷冻离心10 min，取上清液用于酶活性测定。测定时取1mL粗酶液，加1mL 0.2mol/L柠檬酸缓冲液（pH7.0），加0.5mL 0.1mol/L EDTA后振荡，再加0.5mL0.75%可溶性淀粉，摇匀，在37℃水浴中保温40min后，加4mL 10%三氯乙酸(TCA)终止反应。5000×g离心8min，取上清液，加0.3mL碘液显色，10 min后测波长660nm处光密度值，以零时为对照，按△OD660(%)=[OD660(零时-OD660(t时)]/OD660(零时)x100%计算酶活性。

这种方法比较适合近距离的采样，当试验采样地点与酶活测试地点相距较远时，如果将液氮冷冻过后的籽粒样品解冻，剥除再剥除籽粒外壳，不仅需要大量时间，而且由于酶在常温下会失活，温度的变化也会对酶活性的测定产生很大影响，使得实验结果的精度大大降低。然而目前部分试验需要从较远的试验现场采样，再带回实验室测试酶活性，有时也存在采样时没有足够的时间剥除籽粒外壳的情况。这时，怎样才能不考虑籽粒剥壳环节，同时将实验结果影响尽量减少，是困扰众多实验者的一个实用问题。

目前国内尚无相关申请专利，设计一种准确性和精度高、应用前景较广的远程采样水稻籽粒碳代谢关键酶活性检测方法是非常必要的。

发明内容

解决的技术问题：

本申请针对上述技术问题，提供一种在远距离采样不具备去壳可能时，带壳进行远程采样水稻籽粒碳代谢关键酶活性检测方法，解决现有测定方法操作复杂、准确性和精度低等技术问题。

技术方案：