[发明专利]一种远程采样水稻籽粒碳代谢关键酶活性检测方法

权利要求书

1.一种远程采样水稻籽粒碳代谢关键酶活性检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

第一步：在抽穗期，选取生长整齐一致且同日抽穗的稻穗挂牌标记，采样时间为抽穗后10天、17天和25天；

第二步：现场采样后将籽粒装入冻存管用液氮冷冻处理后，运输至目的地后保存于-20℃~-80℃冰柜中；

第三步：取样品籽粒15粒，带壳带胚，称量0.2-0.4g，在预冻的研钵中先加入冷冻的籽粒研磨，研磨完全后在研钵中分两次每次3mL加入缓冲液，第二次将研钵冲洗干净得研磨液；

第四步：研磨液在冷冻离心机离心后取上清液用于酶活性测定，所述上清液为粗酶液；

第五步：通过碳代谢关键酶活力计算公式对粗酶液进行ADPG焦磷酸化酶活性测定和可溶性淀粉合成酶活性测定。

2.根据权利要求1所述的远程采样水稻籽粒碳代谢关键酶活性检测方法，其特征在于：所述碳代谢关键酶活力计算公式为（U/g）＝ΔA×V_T/(0.01×V_s×t×W_F)，公式中ΔA—反应时间内吸光值的变化；V_T—粗酶提取液总体积（6mL）；V_s—测定用粗酶液体积（0.5mL）；W_F—样品鲜重（g）；0.01—A每下降0.01为1个酶活单位（U）；t—反应时间（30min）。

3.根据权利要求1所述的远程采样水稻籽粒碳代谢关键酶活性检测方法，其特征在于：所述第三步中的缓冲液由100mmol/L Hepes-NaOH、5mmol/L MgCl₂、5mmol/L DTT和2%（W/V）PVP配制而成，所述Hepes-NaOH的pH=7.6。

4.根据权利要求1所述的远程采样水稻籽粒碳代谢关键酶活性检测方法，其特征在于：所述第四步中冷冻离心机转速为10000-16000 r/ min，离心时间为10-15min。

5.根据权利要求1所述的远程采样水稻籽粒碳代谢关键酶活性检测方法，其特征在于：所述第五步中ADPG焦磷酸化酶活性测定方法为：在550μL 混合液中加入粗酶液100μL，反应20-30min后，在沸水浴中加热30-50s终止反应，再在10000-16000r/min下离心10-20min后取上清液500μL，上清液中加入100μL反应液，30-40℃下反应10-30min，加入pH=7.4-7.6的Hepes-NaOH缓冲液2mL，再测定340 nm处OD值；所述混合液由100mmol/L Hepes-NaOH、1.2mmol/LADPG、3mmol/L PPi、5mmol/LMgCl₂和4mmol/L DTT配制而成，其中Hepes-NaOH 的pH=7.4；所述反应液由6mmol/L NADP、1.5IU葡萄糖磷酸变位酶和1.5IU磷酸葡萄糖脱氢酶配制而成。

6.根据权利要求1所述的远程采样水稻籽粒碳代谢关键酶活性检测方法，其特征在于：所述第五步中可溶性淀粉合成酶活性测定方法为：在180μL 的混和液中加入100μL粗酶液，在30℃下反应10min，沸水浴中加热10-30s终止反应，再在冰浴中冷却；冷却后再加入100μL的反应液，在沸水浴中加热30-40s终止反应，再在10000-16000r/min下离心5-10min；所述混合液由50mmol/L Hepes-NaOH、1.6 mmol/L ADPG、0.7g支链淀粉和15 mmol/L DTT配制而成，所述反应液由50 mmol/L Hepes-NaOH、4 mmol/L PEP、200mmol/L KCl、10mmol/L MgCl₂和1.2 U的丙酮酸激酶配制而成，混合液和反应液中Hepes-NaOH 的pH =7.4。

7.根据权利要求6所述的远程采样水稻籽粒碳代谢关键酶活性检测方法，其特征在于：所述离心后取上清液350μL，加入反应液300μL，30-40℃下反应10-30min后，加入pH =7.4-7.6的Hepes-NaOH缓冲液2mL，测定340nm OD值；所述反应液由50mmol/L Hepes-NaOH、10mmol/L葡萄糖、20mmol/L MgCl₂、2mmol/L NADP、1.4U己糖激酶和0.35U G-6P脱氢酶配制而成，其中Hepes-NaOH 的pH =7.4。