[发明专利]一种敲除转基因植物中潮霉素抗性基因的方法

说明书

本发明公开了一种敲除转基因植物中潮霉素抗性基因的方法，解决了现有转基因植物普遍存在的选择标记基因潮霉素抗性基因的去除问题。从而在技术上解决了再次转基因选择标记基因难找的问题，而且在农业生产上，也排除了潮霉素抗性基因存在于转基因农作物中不利于人体健康的问题、以及潮霉素抗性基因植物对生态环境存在潜在危害的问题。本发明利用CRISPR/Cas9技术原理构建潮霉素基因编辑载体，载体质粒通过农杆菌介导的方法转化植物。依转化植株的不同，获得的转基因植株通过杂交或/和自交后，筛选得到潮霉素抗性基因敲除、并且不含有用于编辑潮霉素抗性基因所转入植株的Cas9基因等外源DNA的植株。

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，具体涉及一种敲除转基因植物中潮霉素抗性基因的方法。

背景技术

在植物转基因研究中，通常是将目标基因(Gene of Interest,GOI)与位于同一载体的选择标记基因(Selectable Marker Gene,SMG)，一起转入植物细胞，通过对SMG的筛选获得含有GOI的转化细胞。该转化细胞再生形成植物，通过进一步对GOI的确认，从而获得需要的转基因植株。

这种转基因植物就带有SMG，通常是耐抗生素或除草剂抗性基因，如卡那霉素抗性基因(nptII基因)、潮霉素抗性基因(hpt基因)或除草剂抗性基因(bar基因)。SMG不仅对农作物生长没有任何必要，往往也可能会对细胞的发育和分化产生负面的影响；而且当一个转基因植物中已含有一个SMG，在导入第二个GOI时，要选用不同的SMG，而实际中往往需要转入多个基因来改良农作物性状，但能够被运用的SMG数量是有限的，因此，存在于转基因植株基因组中的SMG对多个GOI导入造成困难。

况且，SMG在收获的农产品中的残留，也有可能对人畜等食物链下游生物产生不良影响，特别是对人体健康可能存在着潜在危害，是普通大众担忧转基因食品安全的重要因素；此外，带有SMG的转基因作物在田间的大量种植，这些基因转移到其它生物中的可能性也是存在的，从而会对整个生态环境产生极其严重的后果。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种敲除转基因植物中潮霉素抗性基因(hygromycin phosphotransferase,hpt)的方法。将转基因植物中潮霉素抗性基因敲除，在转基因领域为转入多个目标基因提供条件，并且也使得转基因植物在农业上应用更加安全。

本发明通过下述技术方案实现：

一种敲除转基因植物中潮霉素抗性基因的方法，包括：

1)基于CRISPR/Cas9技术原理，依据潮霉素抗性基因DNA序列SEQ No.1确定sgRNA目标序列，潮霉素抗性基因DNA序列编码的蛋白质氨基酸序列SEQ No.2所示；

依据上述步骤确定的目标序列设计出相应的PCR引物，并采用重叠延伸PCR方法构建sgRNA表达盒，转录sgRNA的启动子的选择及编辑载体的选择依植物确定；

2)将上述步骤1)得到的sgRNA表达盒连接到基因编辑载体，编辑载体的选择依植物确定；

3)将上述步骤2)获得的载体质粒转入农杆菌中；

4)采用农杆菌介导的方法转化植株，通过植株的杂交或/和自交后筛选获得潮霉素抗性基因敲除、并且不含有用于编辑潮霉素抗性基因所转入植株的外源DNA的植株。

其中一种途径：用上述步骤4)中采用农杆菌介导的方法转化野生型植株，通过植株的杂交和自交后筛选出植株的方法为：