[发明专利]一种敲除转基因植物中潮霉素抗性基因的方法

权利要求书

1.一种敲除转基因植物中潮霉素抗性基因的方法，其特征在于，包括：

1)、根据潮霉素抗性基因DNA序列，设计并构建一个或多个sgRNA表达盒；

2)、将一个或多个sgRNA表达盒克隆到编辑载体上；

3)、将克隆得到的编辑载体转入农杆菌中；

4)、采用农杆菌介导的方法转化植株，通过植株的杂交或/和自交后，筛选获得潮霉素抗性基因敲除、并且不含用于编辑潮霉素抗性基因所转入植株的外源DNA的植株。

2.根据权利要求1所述的一种敲除转基因植物中潮霉素抗性基因的方法，其特征在于，采用农杆菌介导的方法转化植株，通过植株的杂交和自交后筛选出植株的方法为：

采用农杆菌转化植株的方法，将编辑潮霉素抗性基因的DNA片段转入野生型植株，得到编辑潮霉素抗性基因的转基因植株；将得到的编辑潮霉素抗性基因的植株与要含有潮霉素抗性基因的植株进行杂交，得到杂交种F1，F1代自交获得F2代植株，在F2代植株中筛选出潮霉素抗性基因敲除、并且不含用于编辑潮霉素抗性基因所转入植株的外源DNA的植株；

采用农杆菌介导的方法转化含有潮霉素抗性基因的植株，通过植株的自交后筛选出植株的方法为：

采用农杆菌转化植株的方法，将编辑潮霉素抗性基因的DNA片段直接转入含有潮霉素抗性基因的植株，该转基因植株自交，在自交后代中筛选出潮霉素抗性基因敲除、并且不含有用于编辑潮霉素抗性基因所转入植株的外源DNA的植株。

3.根据权利要求1所述的一种敲除转基因植物中潮霉素抗性基因的方法，其特征在于，所述sgRNA表达盒的构建方法包括：

第一步，依据潮霉素抗性基因DNA序列设计一个或多个sgRNA目标序列；

第二步，根据目标序列设计构建sgRNA表达盒的PCR引物；

第三步，采用重叠延伸PCR扩增得到sgRNA的DNA片段。

4.根据权利要求1所述的一种敲除转基因植物中潮霉素抗性基因的方法，其特征在于，所述植株为水稻。

5.根据权利要求1所述的一种敲除转基因植物中潮霉素抗性基因的方法，其特征在于，sgRNA表达盒的sgRNA目标序列为：

sgRNA-1：5’-CTCCGACCTGATGCAGCTCTCGG-3’，

sgRNA-2：5’-ACAGACGTCGCGGTGAGTTCAGG-3’；

依据上述两种sgRNA目标序列设计并构建获得的两个sgRNA表达盒与编辑载体pYLCRISPR/Cas9Pubi-B连接，得到的编辑载体质粒PMF117。

6.根据权利要求2所述的一种敲除转基因植物中潮霉素抗性基因的方法，其特征在于，通过分子检测在F1代植株中筛选出发生潮霉素抗性基因缺失植株。

7.根据权利要求2所述的一种敲除转基因植物中潮霉素抗性基因的方法，其特征在于，F2代植株通过分子检测，筛选出发生潮霉素抗性基因敲除、且不含有编辑潮霉素抗性基因所转入水稻植株的外源DNA的植株。

8.根据权利要求2所述的一种敲除转基因植物中潮霉素抗性基因的方法，其特征在于，带有编辑潮霉素抗性基因和潮霉素抗性基因的转基因植株自交，在自交后代中经分子检测，筛选出发生潮霉素抗性基因敲除、且不含有编辑潮霉素抗性基因所转入水稻植株的外源DNA的植株。