[发明专利]用于微生物多样性研究的引物组、接头组和测序方法

说明书

本发明涉及一种用于微生物多样性研究的引物组、接头组和测序方法，包括用于针对微生物16S rRNA基因测序的引物组，用于针对微生物16S rRNA测序扩增的接头组以及利用上述引物组和接头组的测序方法。本发明的测序方法通过对微生物16S rRNA基因的V4区建库测序方法的改进，使其适合于Illumina Nextseq和HiseqX测序平台，大大增加了一次测序的样本数目，有效的降低了单样本测序成本，有效的提升了微生物多样性测序数据的质量、有效率，有效的降低了测序周期，提升了微生物多样性研究的实效性。

技术领域

本发明涉及生物学领域，具体涉及基因组测序领域，特别是微生物多样性研究的测序领域。

背景技术

高通量测序技术又称下一代测序技术(Next-generation Sequencing)，其以超高的通量和测序的准确度优势在科学研究和临床诊断中得到了广泛的应用。而目前在高通量测序领域，Illumina测序平台一枝独秀，占领了超过50％的测序平台市场份额，旗下拥有不同型号和测序能力的测序仪器，例如Hiseq X、Nextseq、Miseq等，这些测序仪器的读长、通量、准确度以及测序时间均有较大差异。Illumina测序的一般流程分为文库制备、簇生成和测序三个步骤，其中构建高质量的测序文库是高通量测序的关键因素。

微生物多样性研究主要基于微生物16S rRNA基因的扩增片段测序技术，通过对测序片段进行分型从而探究环境样本中微生物的组成和丰度。细菌的16S rRNA的序列有10个保守区和9个可变区之分，其中保守区为所有细菌共有，细菌间无差别；可变区具有属或种的特异性，序列则随微生物间的亲缘关系不同而有一定的差异，所以能揭示生物物种的特征核酸序列，被认为是最适于微生物系统发育和分类鉴定的指标，可以利用这一特性设计引物来进行微生物物种鉴定(Soμmitesh Chakravorty et.al.,J Microbiol Methods,2007)。

目前，应用于微生物多样性研究的测序策略主要为Illumina Miseq PE300以及Illumina Hiseq2500PE250平台，这两种平台主要因为其测序读长能很好的覆盖16S rRNA基因的1个或2个高变区而得到应用，而Hiseq X和Nextseq测序平台由于其PE150读长很难覆盖16S rRNA基因的高变区，在微生物多样性研究的应用中受到限制。然而，Miseq和Hiseq2500测序平台在微生物多样性研究方面存在一些缺陷：首先，Miseq测序平台通量有限，目前Miseq测序平台的通量最大能达到15G，而Nextseq测序仪通量是其8倍，HiseqX更高，这使得相比于HiseqX和Nextseq，Miseq测序的平均成本更高；其次，由于MiseqPE300和Hiseq2500PE250的测序读长较长，这造成测序得到的序列末端碱基质量低，用于微生物多样性分析的数据有效率较低；最后，Miseq和Hiseq2500测序周期较Hiseq X和Nextseq长，影响了整个研究的周期和实效性。

因此，构建适合于Nextseq和HiseqX测序平台的微生物多样性研究的测序文库，对于有效的节约微生物多样性研究的成本，提高其测序数据有效率，并能缩减测序的周期提高研究的实效性，具有十分重要的作用。然而，如果利用现有的Miseq PE300或者Hiseq2500PE250的建库测序接头和引物直接转用到Nextseq和HiseqX测序平台，用于微生物16S rRNA基因高变区的扩增测序，会由于Nextseq和HiseqX测序平台测序读长过短，测序得到的序列无法拼接得到完整的微生物16S rRNA基因高变区序列，以致于无法进行微生物多样性研究。因此，现有技术中没有适用于Nextseq和HiseqX测序平台的，通过对16S rRNAV4区进行测序，进而微生物多样性研究测序文库的构建方法。

发明内容

发明要解决的问题

基于现有技术中存在的上述缺陷，本发明提供了一种适合于Nextseq和HiseqX测序平台的微生物多样性研究的建库测序技术。