[发明专利]降钙素原突变体及其制备方法和用途

说明书

本发明公开了一种降钙素原突变体，该降钙素原突变体具有SEQ ID No:1所示的氨基酸序列，或者该降钙素原突变体具有将SEQ ID No:1所述的氨基酸序列经过一个或者几个氨基酸残基的取代、缺失或者添加后仍具有降钙素原突变体的稳定性的氨基酸序列；其中所述降钙素原突变体片段结构为降钙素原氨基多肽‑连接臂1‑降钙素‑连接臂2‑降钙蛋白，所述连接臂1为‑Ala‑Gly‑，所述连接臂2为‑Ala‑Gly‑Ala‑Gly‑。本发明还公开了该降钙素原突变体的制备方法和用途。本发明通过对天然降钙素原蛋白中的2个水解位点58‑59aa和92‑95aa进行替换，得到了一种降钙素原突变体，提高了降钙素原体外稳定性。同时本发明采用柔性连接臂替换上述水解位点，使获得的降钙素原突变体保留天然降钙素原蛋白的抗原性。

技术领域

本发明属于基因工程和蛋白质改造技术领域，具体涉及一种降钙素原突变体及其制备方法和用途。

背景技术

降钙素原(procalcitonin，PCT)是一个小分子蛋白，含有116个氨基酸残基，分子量为大约13kDa。降钙素通常由甲状腺C细胞产生，经过连续的裂解后行成3个分子：N端部分(N端PCT，57个氨基酸残基)、降钙素(32个氨基酸残基)和抗钙素(21个氨基酸残基)。血清中PCT水平可以作为鉴定细菌感染程度和抗生素指导使用的临床指标，在提示细菌感染及其感染程度、判断治疗效果、指导抗菌药物治疗等方面发挥了重要的作用。

目前用于检测PCT的方法有酶免法、免疫化学发光法、放射免疫法等，这些方法中都需要用到不同浓度的重组的PCT抗原作为标准品，制作标准曲线，从而计算样品中PCT的含量，然而目前重组PCT在体外极不稳定，容易降解，极大地影响临床PCT标准品的稳定性及样本检测结果的准确性。现有研究显示PCT在高尔基体中，经系列水解酶作用最终可形成PCT氨基多肽(1-57aa)、降钙素(60-91aa)及降钙蛋白(96-116aa)。由此推断出看出58-59aa和92-95aa为水解位点，这些水解酶位点的存在极可能是导致PCT参考品不稳定的重要因素。

发明内容

本发明的目的在于对天然降钙素原蛋白进行改造，在保持原有天然降钙素原活性的同时，使改造后的降钙素原蛋白突变体在稳定性方面有显著提高。

本发明提供了一种降钙素原突变体，该降钙素原突变体具有SEQ ID No:1所示的氨基酸序列，或者该降钙素原突变体具有将SEQ ID No:1所述的氨基酸序列经过一个或者几个氨基酸残基的取代、缺失或者添加后仍具有降钙素原突变体的稳定性的氨基酸序列；其中所述降钙素原突变体片段结构为降钙素原氨基多肽-连接臂1-降钙素-连接臂2-降钙蛋白，所述连接臂1为-Ala-Gly-，所述连接臂2为-Ala-Gly-Ala-Gly-。

在一个优选实施例中，所述降钙素原突变体具有SEQ ID No:1所示的氨基酸序列。

本发明另一方面提供了一种编码降钙素原突变体的基因，所述基因具有SEQ IDNo:2所示的核苷酸序列，或者所述基因具有编码SEQ ID No:1所示的氨基酸序列的核苷酸序列。

在一个优选实施例中，所述基因具有SEQ ID No:2所示的核苷酸序列。

本发明另一方面提供了一种重组载体，所述重组载体含有如权利要求3所述的基因。

本发明还提供了一种降钙素原突变体的制备方法，包括以下步骤：

a.降钙素原突变体氨基酸序列的设计：采用连接臂1-Ala-Gly-和连接臂2-Ala-Gly-Ala-Gly-分别替换天然降钙素原蛋白位于58-59aa序列-Lys-Arg-和位于92-95aa序列-Gly-Lys-Lys-Arg-，获得序列SEQ ID No:1；