[发明专利]一种体外蛋白合成体系、试剂盒及其制备方法

说明书

本发明提供了一种体外蛋白合成体系、试剂盒及其制备方法，具体地，本发明由特定比例的(a)细胞提取物；和(b)第一反应促进剂混合所形成的无细胞的体外蛋白合成体系可显著提高外源蛋白的合成效率。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，本发明涉及一种体外蛋白合成体系、试剂盒及其制备方法。

背景技术

生物反应即生物化学反应，就是指在生物体内进行的化学反应，这些反应都由酶催化，酶和反应物溶于内环境的水中，才能发生反应，水为体内物质提供载体和介质[1]。在20世纪的最后几十年里，生物化学在解释生命过程方面已经取得了非常大的成就，现在几乎植物学，医学，遗传学等生命科学相关的领域都有从事生物化学研究[2]。

传统的蛋白表达系统是指通过模式生物细菌、真菌、植物细胞或动物细胞等表达外源基因的一种多步级联生物化学反应术[3-4]。随着科学技术的发展，无细胞表达体系也称为体外蛋白合成系统应运而生，其是以外源目的mRNA或DNA为蛋白质合成模板，通过人工控制补加蛋白质合成所需的底物和转录、翻译相关蛋白因子等物质，能实现目的蛋白质的合成[5-7]。体外翻译系统中表达蛋白质无需进行质粒构建、转化、细胞培养、细胞收集和破碎步骤，是一种快速、省时、便捷的蛋白质表达方式[8]。随着科学技术的发展，蛋白合成体系已经开始得到广泛应用。

在生物体或细胞中所进行的生物化学反应，在复杂的网络体系中都可以通过正、负反馈得到自动调控，并且在生物体中所进行的生物化学反应都是远离平衡点的反应，它需要从外界获取能量或向外界输出物质、能量和熵[9]。在细胞内，生物反应的副产物去除主要是靠机体新陈代谢、机体稳态的维持、生物酶的催化作用以及细胞内远离平衡点的氧化还原反应达到，但这些生化反应在体外生物技术是难以实现的[10]。另外，蛋白合成体系存在的一个缺点是产量不高，反应不够快速、灵敏，体外生物合成体系中，比如体外蛋白质合成，体外转录，激酶反应，ATPase反应，离子泵反应等的副产物如自由磷酸根离子、焦磷酸离子(PPi),都会限制目标产物的产量。

目前已知有其他去除反应副产物的方法如通过半透膜允许小分子在反应混合物和透析液之间被动扩散的方法进行半连续反应来控制副产物如自由磷酸根离子。但存在着半透膜透析装置成本高，反应体系不能进行扩大化，反应产物容易堵塞半透膜孔的缺陷。

因此，本领域迫切需要开发并建立一种能够在蛋白合成体系中，通过原位去除(insitu removal)的方式在蛋白合成体系中控制自由磷酸根离子含量来提高蛋白合成效率的方法。

发明内容

本发明的目的在于提供一种能够在蛋白合成体系中，通过原位去除(in situremoval)的方式在蛋白合成体系中控制自由磷酸根离子含量来提高蛋白合成效率的方法。

本发明第一方面提供了一种体外蛋白合成体系，包括：

(a)细胞或细胞提取物、或其组合；

(b)第一反应促进剂，所述第一反应促进剂选自下组：铝、铝盐、氧铝复合物、或其组合。

在另一优选例中，所述细胞选自下组：原核细胞和真核细胞。

在另一优选例中，所述细胞选自下组：大肠杆菌、细菌、哺乳动物细胞(如HF9、Hela、CHO、HEK293)、植物细胞、酵母细胞、或其组合。

在另一优选例中，所述酵母细胞选自下组：酿酒酵母、毕氏酵母、克鲁维酵母、或其组合；较佳地，所述的酵母细胞包括：克鲁维酵母，更佳地为乳酸克鲁维酵母。

在另一优选例中，所述蛋白合成体系还包括：

(b’)第二反应促进剂，所述第二反应促进剂选自下组：单糖、二糖、寡糖、可溶性淀粉、或其组合；

(c)聚乙二醇；

(d)任选的外源蔗糖；和