[发明专利]一种既能减少内部病毒粒子又能包埋外源蛋白的多角体的生产方法

说明书

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种既能减少内部病毒粒子又能包埋外源蛋白的多角体的生产方法，包括以下步骤：(1)构建含有多角体基因的pFast‑PH质粒；(2)构建含有egfp与ac12基因的重组pFast‑PH‑pPH‑ac12‑egfp质粒；(3)构建ac12基因过量表达bacmid‑bAc^ac12OE；(4)转染细胞，获得重组病毒：(5)将上述重组病毒感染细胞，纯化多角体。本发明在多角体基因之后插入重组外源基因片段，既不影响多角体的形成，又能使外源蛋白包埋入多角体；通过杆状病毒高效强力启动子多角体启动子与AC12蛋白融合表达的方法，实现重组蛋白的高水平表达，降低了多角体内部包涵病毒粒子的水平；为进一步开发利用杆状病毒‑昆虫表达系统，为多角体开发成为新型医疗载体和纳米材料创造了条件。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种既能减少内部病毒粒子又能包埋外源蛋白的多角体的生产方法。

背景技术

杆状病毒多角体基因是杆状病毒在感染宿主后的晚期产生的高水平表达蛋白。多角体启动子是杆状病毒极晚期超强表达启动子，现已成功应用于杆状病毒表达系统，用于外源基因的高水平表达。多角体蛋白聚合后可形成超大分子蛋白质结晶多角体。目前的研究表明多角体可保护包埋在多角体内部的病毒粒子和蛋白，使之长时间保存活性。但是多角体内部的病毒粒子的存在使多角体作为医用纳米材料的安全性受到影响，降低多角体包涵的病毒粒子是医学化工工作者的夙愿。

Ac12基因位于AcMNPV基因组nt8958-nt9611之间，基因全长654bp，编码217个氨基酸，分子量25.4kDa。氨基酸序列分析发现Ac12基因含有一个F-box基序。F-box蛋白是一类含有F-box基序(motif)，在泛素介导的蛋白质水解过程中具有底物识别特性的蛋白质家族。通常，F-box蛋白通过自身的F-box基序与Skp1结合，连接到SCF(Skp1-Cdc53-F-boxprotein complex)复合体上。这类蛋白质在细胞时相转换、信号传导、发育等多种生理过程中都具有重要功能。AC12同源体只存在于三个鳞翅目昆虫NPV，包括PlxyNPV，RoMNPV和LdMNPV。有报道表明ac12基因对出芽型病毒粒子(BV)的产生是非必需的。

发明内容

本发明为了克服上述现有技术存在的问题，提供了一种既能减少内部病毒粒子又能包埋外源蛋白的多角体的生产方法。

为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案：

一种既能减少内部病毒粒子又能包埋外源蛋白的多角体的生产方法，包括以下步骤：

(1)构建含有多角体基因的pFast-PH质粒；

(2)构建含有egfp与ac12基因的重组pFast-PH-pPH-ac12-egfp质粒；

(3)构建ac12基因过量表达bacmid-bAc^ac12OE；

(4)转染细胞，获得重组病毒：

(5)将上述重组病毒感染细胞，纯化多角体。

本发明利用杆状病毒的特性，构建了多角体启动子控制下ac12融合外源基因的重组病毒。为了不影响多角体基因的表达，通过同源重组方法将体外构建的多角体启动子外源蛋白基因插入多角体基因之后。本发明的技术路线不影响杆状病毒的水平传播(BV生成)，适用于市场化大规模生产该多角体。这样既降低了多角体中病毒粒子的包涵量，又不影响外源蛋白在多角体中的含量，为进一步利用杆状病毒开发新型纳米材料创造了条件。

作为优选，步骤(1)为：克隆多角体基因，酶切后连接入pFastBacI载体，得到pFast-PH重组载体。