[发明专利]一种既能减少内部病毒粒子又能包埋外源蛋白的多角体的生产方法

权利要求书

1.一种既能减少内部病毒粒子又能包埋外源蛋白的多角体的生产方法，其特征在于，包括以下步骤：

（1）构建含有多角体基因的pFastBacI-PH质粒；所述多角体基因来源于苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒AcMNPV；

（2）构建含有多角体启动子、egfp与ac12基因的重组pFastBacI-PH-pPH-ac12-egfp质粒；所述ac12基因来源于苜蓿银纹夜蛾核型多角体病毒AcMNPV；

（3）构建ac12基因过量表达质粒bacmid-bAc^ac12OE；

（4）转染细胞，获得重组病毒；

（5）将上述重组病毒感染细胞，纯化多角体。

2.根据权利要求1所述的一种既能减少内部病毒粒子又能包埋外源蛋白的多角体的生产方法，其特征在于，步骤（1）为：克隆多角体基因，酶切后连接入pFastBacI载体，得到pFastBacI-PH重组载体。

3.根据权利要求1所述的一种既能减少内部病毒粒子又能包埋外源蛋白的多角体的生产方法，其特征在于，步骤（2）为：克隆egfp与基因ac12，酶切后依次连接入pFastBacI载体，得到pFastBacI-egfp和pFastBacI-ac12-egfp重组载体；以pFastBacI-ac12-egfp为模板，扩增pPH-ac12-egfp序列并克隆入pFastBacI-PH载体，得到pFastBacI-PH-pPH-ac12-egfp。

4.根据权利要求3所述的一种既能减少内部病毒粒子又能包埋外源蛋白的多角体的生产方法，其特征在于，步骤（3）为：

A）以egfp基因为模板，利用PCR技术扩增egfp基因；PCR所用的引物分别为egfp-F：5’-TCTAGAATGCCGAATTATTCATACACC-3和egfp-R：5’-GCATGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’；以AcMNPV基因为模板，利用PCR技术扩增多角体和ac12基因；多角体所用的引物分别为PH-F：5’-AGATCTATGCCGGATTATTCATACC-3’和PH-R：5’-AGATCTTTAATACGCCGGACCAGTG-3’；Ac12所用的引物为Ac12-F：5’-GGATCCATGTACAGGCACGCGTGCT-3’和Ac12-R：5’-TCTAGATGTATTTATTTCGTATAAATAATATATAAAGTTTGATTGTAC-3’；

B）通过琼脂糖凝胶电泳将多角体基因PCR产物回收，经BglII酶切后克隆至pFastBacI载体，得到pFastBacI-PH；

C）随后将egfp基因经XbaI和SphI酶切后克隆入pFastBacI，获得pFastBacI-egfp；随后将Ac12扩增，经BamHI和XbaI酶切后克隆入pFastBacI-egfp获得pFastBacI-Ac12-egfp；

D）以获得的pFastBacI-Ac12-egfp为模板，用引物pPH-F：5’- GCATGCTAGATCATGGAGATAATTAAAATGATAACC-3和egfp-R：5’-GCATGCTTACTTGTACAGCTCGTCCATG-3’扩增pPH-AC12-EGFP，随后分别将pPH-AC12-EGFP克隆入pFastBacI-PH，得到pFastBacI-PH-pPH-ac12-egfp；

E）将重组质粒pFastBacI-PH-pPH-AC12-EGFP转化入含有helper质粒及AcMNPV修饰基因组bacmid的DH10Ac；经转座获得重组杆状病毒质粒bacmid-bAc^ac12OE。

5.根据权利要求1所述的一种既能减少内部病毒粒子又能包埋外源蛋白的多角体的生产方法，其特征在于，步骤（3）为：将构建pFastBacI-PH-pPH-ac12-egfp质粒分别转化入DH10Ac中，得到ac12基因过量表达大质粒bacmid-bAc^ac12OE。