[发明专利]一种胎盘组织冻存、复苏和制备间充质干细胞的方法

说明书

发明涉及一种胎盘组织冻存、复苏和制备间充质干细胞的方法，其包括如下步骤：对胎盘组织进行清洗；从组织剪下胎盘小叶，并用粉碎机粉碎；配制胎盘组织低温保护液备用；将粉碎后的组织与保护液混合后分装至冻存管中，先后在4℃下冷藏0.5小时，‑20℃冷藏2小时，‑80℃下冷冻1天，最后液氮中冷冻备用；需要时将胎盘组织冻存管从液氮中取出，恒温水浴解冻；使用缓冲液清洗后，双酶法消化胎盘组织；过滤收集细胞，使用间充质干细胞培养基培养与扩增间充质干细胞。本发明方法可有效冻存与复苏胎盘组织，制备间充质干细胞。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种胎盘组织冻存、复苏和制备间充质干细胞的方。

背景技术

间充质干细胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一种能够进行自我更新、多分化潜能的多能干细胞，可以向神经细胞、心肌细胞、肌细胞等多种终末组织器官的细胞分化，其在细胞替代治疗、支持造血、基因治疗等方面有着广泛的应用前景。

研究显示，胎盘组织中也含有间充质干细胞并且能成功分离。这种组织来源的间充质干细胞不仅保持了间充质干细胞的生物学特性，而且分离出来的干细胞更原始，有更强的增殖分化能力。其免疫细胞的功能活性低，大大将低了触发免疫反应及引起移植物抗宿主病的风险。潜伏性病毒和微生物的感染及传播几率比较低。采集过程简单，对产妇及新生儿无任何危害及损伤。以上原因使得胎盘间充质干细胞成为研究的热点。

但是，胎盘组织分离干细胞的方法和技术还不是完全成熟，而且每一份胎盘组织的处理和分离后的细胞培养都需要一定的时间和人员的消耗。因此将胎盘组织冻存并且在有需要的时候复苏进行干细胞分离的做法相对更符合成本效益。因此，本领域需要一个简单和高效的胎盘组织冻存、复苏和制备间充质干细胞的方法，以满足医药、科研、临床等领域的需求。

发明内容

为解决现有技术的不足，本发明提供了一种胎盘组织冻存、复苏和制备间充质干细胞的方法。

本发明第一方面提出一种胎盘组织冻存、复苏和制备间充质干细胞的方法，其特征在于，其包括以下步骤：

(1)通过PBS缓冲液清洗胎盘组织，使胎盘组织表面残留血液冲洗干净，胎盘表面无血液凝块；

(2)使用组织剪剪下步骤(1)得到的胎盘组织的胎盘小叶，然后使用粉粹机将胎盘小叶粉粹成小块组织；

(3)将步骤(2)获得的小块组织，按照1:1体积比加入预冷保护剂，混合均匀，分装至多个冻存管中，所述保护剂为玻璃化溶液与间充质干细胞培养基的混合液；

(4)将步骤(3)获得的冻存管先后在4℃下冷藏0.5小时，-20℃冷藏2小时，-80℃下冷冻1天，最后在-196℃液氮中冷冻备用；

(5)需要时将步骤(4)冷冻的组织块从液氮中取出，在恒温水浴中解冻，用移液管吸取解冻的组织块，放入洁净的离心管中，加入PBS缓冲液混匀，然后离心，去掉上清液；

(6)在步骤(5)清洗后的组织块中，先后加入0.1％II型胶原酶和0.25％胰酶进行消化，使用筛网过滤收集细胞溶液，然后离心，去掉上清液；

(7)使用间充质干细胞培养基重悬步骤(6)获得的细胞沉淀，放入预先置有间充质干细胞培养基的培养瓶中，置于CO₂培养箱内培养；以及

(8)在培养后的3-4天进行第一次换液，以后3-4天换一次液，待细胞融合度达到70％以上后，使用胰蛋白酶进行消化后传代，即获得胎盘间充质干细胞。

根据本发明的一个实施例，所述胎盘小叶大小为5cm×5cm；所述小块组织大小为3mm×3mm。

根据本发明的一个实施例，所述保护剂为玻璃化溶液与间充质干细胞培养基按照体积比为1:9进行混合而成。