[发明专利]一种胎盘组织冻存、复苏和制备间充质干细胞的方法

权利要求书

1.一种胎盘组织冻存、复苏和制备间充质干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

(1)通过PBS缓冲液清洗胎盘组织，使胎盘组织表面残留血液冲洗干净，胎盘表面无血液凝块；

(2)使用组织剪剪下步骤(1)得到的胎盘组织的胎盘小叶，然后使用粉粹机将胎盘小叶粉粹成小块组织；

(3)将步骤(2)获得的小块组织，按照1:1体积比加入预冷保护剂，混合均匀，分装至多个冻存管中，所述保护剂为玻璃化溶液与间充质干细胞培养基的混合液；

(4)将步骤(3)获得的冻存管先后在4℃下冷藏0.5小时，-20℃冷藏2小时，-80℃下冷冻1天，最后在-196℃液氮中冷冻备用；

(5)需要时将步骤(4)冷冻的组织块从液氮中取出，在恒温水浴中解冻，用移液管吸取解冻的组织块，放入洁净的离心管中，加入PBS缓冲液混匀，然后离心，去掉上清液；

(6)在步骤(5)清洗后的组织块中，先后加入0.1％II型胶原酶和0.25％胰酶进行消化，使用筛网过滤收集细胞溶液，然后离心，去掉上清液；

(7)使用间充质干细胞培养基重悬步骤(6)获得的细胞沉淀，放入预先置有间充质干细胞培养基的培养瓶中，置于CO₂培养箱内培养；以及

(8)在培养后的3-4天进行第一次换液，以后3-4天换一次液，待细胞融合度达到70％以上后，使用胰蛋白酶进行消化后传代，即获得胎盘间充质干细胞。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述胎盘小叶大小为5cm×5cm；所述小块组织大小为3mm×3mm。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述保护剂为玻璃化溶液与间充质干细胞培养基按照体积比为1:9进行混合而成。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述玻璃化溶液含有体积分数27-32％甘油、12-16％乙二醇、12-16％二甲基亚砜和质量分数0.3-0.5M蔗糖。

5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述玻璃化溶液含有体积分数30％甘油、15％乙二醇、15％二甲基亚砜和质量分数0.4M蔗糖。

6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(6)所述消化的时间为20-30分钟。

7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，间充质干细胞培养基含有：12-18重量份的FBS、0.8-1重量份的L-谷氨酰胺、0.02-0.05重量份的庆大霉素和80-90重量份的DMEM-F12。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，间充质干细胞培养基含有：15重量份的FBS、1重量份的L-谷氨酰胺、0.04重量份的庆大霉素和85重量份的DMEM-F12。

9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包括步骤：

(9)针对步骤(8)所得胎盘间充质干细胞，检测以下项目的至少一项：细胞活性、细胞污染、遗传病、HLA-ABC/DR配型；或

(10)将步骤(8)所得传代后的胎盘间充质干细胞于液氮中冻存，备用。

10.一种建立胎盘干细胞数据库的方法，其特征在于，所述方法包括权利要求1-9任一项所述方法的步骤，以及以下步骤：将传代后的细胞于液氮中冻存并记录相关胎儿信息，并进行细胞的生物学特性及多向分化潜能鉴定，以及对细胞进行分子遗传学诊断，保存细胞的所有相关数据，建立胎盘干细胞的数据库并与冻存细胞进行关联。