[发明专利]提取鱼类肌肉组织基因组DNA的方法

说明书

本发明涉及一种提取鱼类肌肉组织基因组DNA的方法。所述方法将一定量的鱼类肌肉组织在研钵中利用液氮研磨成粗粉，加入一定量的核提取液来提取细胞核，随后离心将大部分杂质与细胞核分离，并用percoll细胞分离混合溶液进一步进行核层分离，并最终将细胞核包埋于低熔点琼脂糖凝胶中，最后在胶块中进行蛋白、RNA等物质的去除。

技术领域

本发明属于生物化学领域，具体涉及一种提取鱼类肌肉组织基因组DNA的方法。

背景技术

自人类基因组计划完成后，测序技术实现了突飞猛进的发展速度，尤其是近些年二代和三代测序技术的不断成熟和测序成本的不断降低，极大的推动了人类对于动植物基因组学的认识，而获得完整性高、纯净度好的基因组DNA是获得真实、准确的基因组信息的前提和关键。目前关于鱼类肌肉组织高分子量核DNA提取的报告很少，要高效地提取出完整性好的鱼类肌肉组织核DNA并不简单，主要是鱼类肌肉组织含有较多的肌纤维，研磨难度较大，如研磨时间过短，组织不能破碎，很难提取出核；研磨时间增长或者研磨力度过大，都会使核膜破裂导致未受到保护的DNA断裂，其次是离心和细胞核洗涤步骤方法不同，在核提取的浓度、纯度、完整性和效率上也会出现不同效果。一旦方法不对就会提取出不合格的核DNA，导致其在二代和三代测序技术中造成文库构建失败或信息分析异常。

因此有必要开发一种能够完整的提取鱼类肌肉组织基因组DNA的方法，为进一步推动基因组的研究和利用提供有效手段。

发明内容

本发明的目的在于解决存在于鱼类肌肉组织基因组提取方法中存在的难点，提供一种新的完整提取该组织基因组的方法。

本发明提供了一种提取鱼类肌肉组织基因组DNA的方法，所述方法包括以下步骤：

(一)将鱼类肌肉组织在液氮预冷的研钵中研磨成粗粉，加入核提取液进行核提取，用孔径为80-100μm的过滤网过滤核提取液，将滤液在2-4℃离心机中，600g-650g离心10-15min，弃掉上清，收集沉淀；

(二)用核提取液重悬步骤(一)获得的沉淀，再用孔径为20-40μm的过滤网过滤重悬液，滤液部分在2-4℃离心机中，50g-60g离心1-2min，收集上清，再将上清液在2-4℃离心机中，600g-650g离心10-15min，弃掉上清，用核提取液重悬沉淀，最后将重悬液加到percoll细胞分离混合溶液上方，2-4℃离心机中，600g-650g离心30-50min后将中间层及中间层下方1-2mL液体吸出获得核液；

(三)用核提取液和0.5-1xPBS溶液重悬步骤(二)所得核液后，离心去除percoll细胞分离混合溶液并收集沉淀，将沉淀用CSB溶液重悬并在43-45℃金属浴3-4min后与琼脂糖液混匀制胶块；

其中，所述percoll细胞分离混合溶液的组成成分包括20-30％(体积)的核提取液和70-80％(体积)的percoll细胞分离液。

其中，所述核提取液的组成成分包括：10mM-15mM Tris-HCL，10mM-25mM EDTA，50mM-80mM氯化钾，0.5M-1.5M蔗糖，0.5mM-1.5mM精胺，0.5mM-1.5mM亚精胺，0.25-0.5％(体积)TritonX-100，2.5-7.5％(体积)β-巯基乙醇和8-10％(w/v)PVP10(聚乙烯吡咯烷酮)。

其中，所述Percoll细胞分离液是经过聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrolidone，PVP)处理的硅胶颗粒混悬液，对细胞无毒性和刺激性。Percoll混悬液的硅胶颗粒大小不一，经过高速离心后，可形成一个连续密度梯度，将比重不同的细胞分离纯化。

在本发明的一种优选的实施方式中，percoll细胞分离混合溶液可以为购自Pharmacia公司的商品名为Percoll的产品。

其中，以g/mL计，步骤(一)中鱼类肌肉组织与核提取液按照1：8-10的质量体积比混合。