[发明专利]提取鱼类肌肉组织基因组DNA的方法

权利要求书

1.一种提取鱼类肌肉组织基因组DNA的方法，其特征在于，

包括以下步骤：

(一)将鱼类肌肉组织在液氮预冷的研钵中研磨成粗粉，加入核提取液进行核提取，用孔径为80-100μm的过滤网过滤核提取液，将滤液在2-4℃离心机中，600g-650g离心10-15min，弃掉上清，收集沉淀；

(二)用核提取液重悬步骤(一)获得的沉淀，再用孔径为20-40μm的过滤网过滤重悬液，滤液部分在2-4℃离心机中，50g-60g离心1-2min，收集上清，再将上清液在2-4℃离心机中，600g-650g离心10-15min，弃掉上清，用核提取液重悬沉淀，最后将重悬液加到percoll细胞分离混合溶液上方，2-4℃离心机中，600g-650g离心30-50min后将中间层及中间层下方1-2mL液体吸出获得核液；

(三)用核提取液和0.5-1xPBS溶液重悬步骤(二)所得核液后，离心去除percoll细胞分离混合溶液并收集沉淀，将沉淀用CSB溶液重悬并在43-45℃水浴3.5-4.5min后与琼脂糖液混匀制胶块；

其中，所述percoll细胞分离混合溶液的组成成分包括20-30％(体积)的核提取液和70-80％(体积)的percoll细胞分离液。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，步骤(二)中相对于每毫升的所述滤液部分，percoll细胞分离混合溶液的用量为1-1.5mL。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，以g/mL计，步骤(一)中鱼类肌肉组织与核提取液按照1：8-10的质量体积比混合。

4.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤(三)中所述CSB溶液的组成成分为：10mM-15mM Tris-HCL，10mM-25mM EDTA。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述核提取液的组成成分包括：10mM-15mM Tris-HCL，10mM-25mM EDTA，50mM-80mM氯化钾，0.5M-1.5M蔗糖，0.5mM-1.5mM精胺，0.5mM-1.5mM亚精胺，0.25-0.5％(体积)TritonX-100，2.5-7.5％(体积)β-巯基乙醇和8-10％(w/v)PVP10。

6.根据权利要求1-5任一项所述的方法，其特征在于，步骤(一)还包括，将鱼类肌肉组织研磨成粗粉后加入到装有核提取液的烧杯中，搅拌15-20min，直到看不到组织样。

7.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括先利用蛋白酶k溶液和RNA酶溶液对胶块进行孵育，再用Wash Buffer和TE溶液对胶块进行清洗获得清洗后胶块，用溶胶酶溶解胶块后透析获得鱼类肌肉组织基因组DNA。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述蛋白酶K溶液的组成成分包括：0.8-1.5mg/mL蛋白酶K、93％-99％(体积)的Lysis buffer；和/或，所述Wash Buffer溶液的组成成分包括：10mM-15mM Tris-HCL，50mM-80mM EDTA 。

9.根据权利要求1-6任一项所述的方法，其特征在于，所述方法还包括以下步骤：

(四)48-52℃下用5-25倍体积的蛋白酶k溶液浸没胶块孵育1.5-2.5h后在15-25℃下静置4-6分钟，静置结束后去除液体组分，再用5-25倍体积的蛋白酶K溶液孵育12-24h，结束后在15-25℃下静置4-6分钟获得蛋白酶k孵育后胶块；

(五)将所述蛋白酶k孵育后胶块在RNA酶溶液中孵育去除RNA获得RNA酶孵育后胶块。

10.根据权利要求1-9任一项所述的方法，其特征在于，所述鱼为金鲳鱼。