[发明专利]一种细胞表面展示有豆壳过氧化物酶的重组酵母菌及其构建方法与应用

说明书

本发明提供了一种细胞表面展示有豆壳过氧化物酶的重组酵母菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。本发明通过设计如SEQ ID No.1所示的核苷酸序列，并将该序列化学合成后连接到pUC57‑simple载体上，然后亚克隆到pMIZY05v2表达载体上，构建重组载体pMIZY05v2‑oEp，经线性化后转化到解脂耶罗威亚酵母PO1h菌株中，得到可表面展示重组豆壳过氧化物酶的工程菌，然后在含有血红素的PPB培养基中培养2～5d，离心收集细胞即得固定化重组豆壳过氧化物酶。利用通过简单离心收集菌体即可得到重组豆壳过氧化物酶，可以省去过氧化酶繁琐的分离纯化步骤，简化生产工艺，降低生产成本。

技术领域

本发明涉及一种细胞表面展示有豆壳过氧化物酶的重组酵母菌及其构建方法与应用，属于基因工程技术领域。

背景技术

过氧化物酶(peroxidase，EC 1.11.1.x)是一类广泛存在于动物、植物及微生物中的氧化还原酶，通常由一条肽链和血红素辅基构成(部分种类还含有Ca²⁺、Mn²⁺等其他金属离子)，能够以H₂O₂或过氧化有机物为电子受体催化多种底物的氧化反应。豆壳过氧化物酶(soybean hull peroxidase，ShP，EC 1.11.1.7)是一种从大豆(Glycine max)豆壳中提取获得的过氧化物酶，属于植物过氧化物酶超家族的第III类(分泌型过氧化物酶)，能以H₂O₂为电子受体催化氧化多种有机和无机底物。天然ShP分子量约40kDa，由304个氨基酸残基组成，等电点3.9，是一种酸性蛋白质。ShP脱辅基蛋白基因cDNA包含一个全长1056bp的开放阅读框，编码含有352个氨基酸残基的前体蛋白。前体蛋白翻译后经过多种修饰最终才能成为有功能的全酶，前体蛋白首先切除N-末端26个信号肽，然后暴露出来的N-末端谷氨酰胺残基环化成焦谷氨酸，之后经切除C-末端22个氨基酸残基的酶原肽(propeptide)、糖基化修饰、结合辅因子、二硫键形成后才能成为成熟的功能酶。糖基化修饰约占该酶总分子量的18％，对于蛋白维持构象和防止降解有重要作用。除血红素外结合位点外，该酶还带有2个Ca²⁺结合位点，对于维持酶的结构和活性具有重要作用。

在第III类植物过氧化物酶中，辣根过氧化物酶(horseradish peroxidase，HRP)因其研究较早而为人所熟知，目前广泛应用于环保、食品添加剂、酶免疫技术、生物传感器等多种领域。与之相比，ShP具有热稳定好、pH适用范围广等多种优势，在多种领域可完全替代HRP而获得更广泛的应用。如美国American Qualex和Enzymol International公司已将ShP应用于病毒、细菌、寄生虫诊断试剂盒的生产。国内王炳全等利用ShP成功研制了H₂O₂检测生物传感器，具有响应时间短、检测灵敏度高、热稳定性好和耐储存等多种优点。ShP用于环保行业，可催化酚、胺等有毒物质的氧化解毒。目前，国外已经有公司将ShP应用于处理工业废水。ShP作为绿色食品添加剂可替代溴酸钾用于面粉中类胡萝卜素的脱色，并抑制蛋白质分解，缩短面粉的成熟期，赋予面粉更好的弹性和强度，在焙烤制品中获得了令人满意的效果。总之，ShP因其多种优点获得了市场青睐。