[发明专利]一种细胞表面展示有豆壳过氧化物酶的重组酵母菌及其构建方法与应用

权利要求书

1.一种细胞表面展示有豆壳过氧化物酶的解脂耶罗威亚酵母PO1h菌株在发酵生产豆壳过氧化物酶中的应用，其特征在于，所述应用的方法包括：

(1)构建细胞表面展示有豆壳过氧化物酶的解脂耶罗威亚酵母PO1h菌株；所述豆壳过氧化酶基因oEp的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

(2)将步骤(2)得到的细胞表面展示有豆壳过氧化物酶的解脂耶罗威亚酵母PO1h菌株接种于含有10μM血红素的液体培养基中培养，离心获得表面展示有有豆壳过氧化物酶的重组酵母细胞，即得固定化的重组豆壳过氧化物酶。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(1)所述构建方法包括以下步骤：

1)化学合成基因序列优化过的豆壳过氧化酶基因oEp，将其连接到克隆载体pUC57-simple中，得到豆壳过氧化物酶基因克隆质粒pUC57S-oEp；所述基因序列优化过的豆壳过氧化酶基因oEp的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示；

2)采用限制性内切酶SfiI和BamHI对豆壳过氧化物酶基因克隆质粒pUC57S-oEp进行双酶切，回收豆壳过氧化酶基因片段，并连接到经同样双酶切消化的表面展示载体pMIZY05v2中，得到豆壳过氧化物表面展示质粒pMIZY05v2-oEp；

3)采用限制性内切酶NotI对豆壳过氧化酶表面展示质粒pMIZY05v2-oEp进行单酶切消化，电泳分离酶切产物，回收纯化大片段，并将其转化至解脂耶罗威亚酵母宿主细胞中，经发酵培养后，获得细胞表面展示有豆壳过氧化物酶的重组酵母菌。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述培养是在20℃～30℃、150rpm～250rpm的条件下振荡培养2d～5d。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，步骤(2)所述含有血红素的液体培养基为添加有血红素的PPB培养基，所述PPB培养基包括如下组分：蔗糖或甘油20g/L，酵母浸粉1.32g/L，KH₂PO₄ 0.32 g/L，NH₄Cl 1.32g/L，MgSO₄ 0.132 g/L，盐酸硫胺素0.334mg/L，在使用时加入1/10000体积的0.1M氯化血红素溶液使其终浓度为10μM。

5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述构建方法表面展示载体pMIZY05v2带有糖基磷脂酰肌醇GPI锚定序列。

6.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，步骤3)所述解脂耶罗威亚酵母宿主细胞为解脂耶罗威亚酵母PO1h菌株。