[发明专利]基于人源化CD276抗体的CAR慢病毒表达载体构建及其应用

说明书

本发明涉及CAR慢病毒表达载体技术领域，尤其是基于人源化CD276抗体的CAR慢病毒表达载体构建及其应用，通过构建包含人源化CD276特异单链抗体(scFv)、CD8信号传导片段、以及CD28或41BB刺激信号分子的CAR序列，制备了靶向CD276的CAR(CD276‑28z‑CAR或CD276‑BBz‑CAR)表达质粒与CAR‑T细胞。本发明采用了人源化的抗CD276scFv作为CAR‑T细胞识别区，可以有效避免免疫排斥发生，有助于治疗效果改善。通过添加胞内刺激信号(CD28或41BB)，能够改善T细胞功能。此类转基因修饰的CAR‑T细胞具备更强、更持久的杀伤能力。

技术领域

本发明涉及CAR慢病毒表达载体的技术领域，具体领域为基于人源化CD276抗体的CAR慢病毒表达载体构建。

背景技术

嵌合抗原受体(CAR)是一种人工合成的结构。利用转基因技术，将CAR序列转导入T细胞中，能够产生识别特异靶点、杀伤肿瘤细胞的CAR-T细胞。CAR-T细胞在血液系统肿瘤中取得了良好的治疗效果，但在实体瘤中效果不佳。

CAR-T细胞治疗实体瘤面临的主要技术问题包括：

1、靶点抗原的表达是否广泛；2、CAR序列是否具有较强免疫原性，导致免疫排斥；3、CAR是否能将识别信号有效传递给T细胞。

发明内容

本发明的目的在于提供基于人源化CD276抗体的CAR慢病毒表达载体构建及其应用，以解决现有技术中CAR-T细胞治疗的问题。

CD276是在肿瘤中广泛表达，是较好的CAR-T细胞治疗靶点。本发明通过构建包含人源化CD276特异单链抗体(scFv)、CD8信号传导片段、以及CD28或41BB刺激信号分子的CAR序列，制备了靶向CD276的CAR(CD276-28z-CAR或CD276-BBz-CAR)表达质粒与CAR-T细胞。

CAR主要由3部分构成：胞外识别区、信号转导区和胞内信号区。其中，胞外识别区决定了CAR-T细胞杀伤的特异性，往往由scFv序列构成，但很多scFv序列是小鼠来源的，会造成较强的免疫排斥反应，导致CAR-T细胞治疗无效。而本发明选择了高亲和性识别CD276的人源化改造的scFv序列(anti-CD276scFv)，既能够有效避免免疫排斥，又能够高效识别靶细胞。胞内信号区也是决定CAR-T细胞治疗效果的重要结构，通过加入共刺激信号分子(CD28或41BB)，保证CAR-T细胞具备较强的杀伤功能与扩增能力。此外，信号转导区的结构选择也影响CAR-T细胞功能。利用CD8铰链区保证胞外识别区与信号区之间有了较好结合，保证了CAR-T细胞的功能。

为提高CAR-T细胞治疗效果，针对现有CAR结构缺陷，本发明对3个主要结构进行了优化，其技术方案具体如下：

基于人源化CD276抗体的CAR慢病毒表达载体构建方法，包括以下步骤：(1)CAR结构优化；(2)CAR序列合成及载体构建；

其中，步骤(1)优化后的CAR结构为CD276-28z-CAR结构或者CD276-BBz-CAR结构；CD276-28z-CAR编码蛋白序列如SEQ ID No:1所示；CD276-BBz-CAR编码蛋白序列如SEQ IDNo:7所示。

本发明所述的基于人源化CD276抗体的CAR慢病毒表达载体构建方法，其特征在于：所述CD276-28z-CAR结构包括人CD8a分子信号肽、人源化CD276单链抗体、人CD8a分子柔性片段、人CD28分子跨膜区与胞内区和人CD3z分子胞内区；

其中，人CD8a分子信号肽序列如SEQ ID No:2所示；人源化CD276单链抗体序列如SEQ ID No:3所示；人CD8a分子柔性片段序列如SEQ ID No:4所示；人CD28分子跨膜区与胞内区序列如SEQ ID No:5所示；人CD3z分子胞内区序列如SEQ ID No:6所示。