[发明专利]基于人源化CD276抗体的CAR慢病毒表达载体构建及其应用

权利要求书

1.基于人源化CD276抗体的CAR慢病毒表达载体构建方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)CAR结构优化；(2)CAR序列合成及载体构建；

其中，步骤(1)优化后的CAR结构为CD276-28z-CAR结构或者CD276-BBz-CAR结构；CD276-28z-CAR编码蛋白序列如SEQ ID No:1所示；CD276-BBz-CAR编码蛋白序列如SEQ IDNo:7所示。

2.根据权利要求1所述的基于人源化CD276抗体的CAR慢病毒表达载体构建方法，其特征在于：所述CD276-28z-CAR结构包括人CD8a分子信号肽、人源化CD276单链抗体、人CD8a分子柔性片段、人CD28分子跨膜区与胞内区和人CD3z分子胞内区；

其中，人CD8a分子信号肽序列如SEQ ID No:2所示；人源化CD276单链抗体序列如SEQID No:3所示；人CD8a分子柔性片段序列如SEQ ID No:4所示；人CD28分子跨膜区与胞内区序列如SEQ ID No:5所示；人CD3z分子胞内区序列如SEQ ID No:6所示。

3.根据权利要求1所述的基于人源化CD276抗体的CAR慢病毒表达载体构建方法，其特征在于：所述CD276-BBz-CAR结构包括人CD8a分子信号肽、人源化CD276单链抗体、人CD8a分子柔性片段与跨膜区、人41BB分子胞内区和人CD3z分子胞内区；

其中，人CD8a分子信号肽序列如SEQ ID No:8所示；人源化CD276单链抗体如SEQ IDNo:9所示；人CD8a分子柔性片段与跨膜区序列如SEQ ID No:10所示；人41BB分子胞内区序列如SEQ ID No:11所示；人CD3z分子胞内区序列如SEQ ID No:12所示。

4.根据权利要求1-3任一所述的基于人源化CD276抗体的CAR慢病毒表达载体构建方法，其特征在于，所述步骤(2)具体包括：合成CAR编码序列，将获得的DNA序列通过酶切连接插入到pCDH-EF1-MSC质粒中，构建慢病毒表达质粒pCDH-EF1-CAR-CD276-28z或pCDH-EF1-CAR-CD276-BBz。

5.根据权利要求4所述的CAR慢病毒表达载体构建方法获得的基于人源化CD276抗体的CAR慢病毒表达载体。

6.采用权利要求5所述的CAR慢病毒表达载体制备CAR-T细胞的方法，其特征在于，包括以下步骤：(1)慢病毒包装；(2)T细胞纯化与感染；(3)T细胞CAR表达效率检测；(4)CAR-T细胞体外扩增；

其中，步骤(1)具体为，包装细胞293T铺板24小时后，将pCDH-EF1-CAR-CD276-28z或pCDH-EF1-CAR-CD276-BBz表达质粒与包装质粒混合，利用磷酸钙转染试剂进行293T细胞转染；转染48小时后，收集上清，准备用于T细胞感染。

7.根据权利要求6所述的制备CAR-T细胞的方法，其特征在于：步骤(2)具体为，人外周血经密度梯度离心后，分离外周血单个核细胞；利用T细胞分离试剂盒获得纯化的CD3⁺T细胞，再按照2个细胞加入1个磁珠的比例，加入适量CD3/CD28磁珠活化2天；2天后，加入病毒上清与polybrene孵育过夜；次日，离心清洗T细胞3次后，加入含1000U/mL IL-2与5％胎牛血清的RPMI1640培养基扩增T细胞。

8.根据权利要求7所述的制备CAR-T细胞的方法，其特征在于：步骤(3)具体为，T细胞感染3天后，利用流式细胞术对T细胞表面CAR的表达情况进行检测。

9.根据权利要求8所述的制备CAR-T细胞的方法，其特征在于：步骤(4)具体为，计数1×10⁶个T细胞进行感染，并在感染后3，7，10和14天时进行计数，检测CAR-T细胞增殖情况。