[发明专利]一种消化RPE细胞的方法

说明书

本发明公开了一种消化RPE细胞以解除其细胞贴壁状态的方法，包括以下步骤：(1)使用1×TrypLE select，使其均匀覆盖于RPE细胞；(2)使用Dispase II溶液，使其均匀覆盖于RPE细胞，其中步骤(1)和(2)是分步实施。

技术领域

本发明总体上涉及生命科学领域，具体涉及一种RPE细胞解除贴壁状态的消化方法。

背景技术

视网膜色素上皮细胞(retinal pigment epithelium，简称RPE)是由单层色素上皮细胞所构成，排列十分规则。细胞呈多角形，细胞分为三部分，即顶部、体部和基底部。RPE是位于视网膜外部的连续单层细胞，因其筛子状的形态和胞质内丰富的黑色素而得名，它们在视网膜细胞的维持和自我更新上发挥重要的功能，如：吞噬消化脱落的光感受器细胞的OS；促进视循环中重要的介质11-顺视黄醛的再生；调节眼内的免疫反应；参与形成视网膜-血管屏障等。

老年性黄斑变性亦称年龄相关性黄斑变性(age-related maculardegeneration，简称AMD)。大多始发于50岁上下，年龄越大，患病率越高。发病与性别、种族无明显关系。双眼同时或先后受害。AMD的症状和诊断主要症状是中心视力下降，视野中心有黑影遮挡，及视物会变形。由于本病原因还不明确，所致至今尚无有效治疗和根本性的预防措施。AMD主要表现为视网膜色素上皮细胞对视细胞外节盘膜吞噬消化能力下降，结果使未被完全消化的盘膜残余小体潴留于基底部细胞原浆中，并向细胞外排除沉积于Bruch膜，形成玻璃膜疣。AMD分为干性和湿性两种，其中，干性AMD更为常见，他是由于RPE进行性营养不良造成的脉络膜毛细血管和光受体缺失的一种疾病。湿性AMD的典型特征是有脉络膜新生血管(choroidal neovascularization，CNV)生成，从而造成严重的视力丧失。除了细胞替代治疗，目前尚无逆转这一退行性过程并回复视力的有效办法。

RPE细胞治疗AMD的试验显示通过在视网膜下腔移植正常RPE细胞，能够延缓进行性的视觉功能丧失。RPE细胞移植在RPE遗传缺陷动物模型和AMD病人上的试验，都显示能够延缓视网膜的退行性病变，改善视觉功能。所以RPE细胞在不久的将来有望成为干细胞药物，但是由于RPE细胞本身的特殊性，成为干细胞药物要克服生产工艺上的两大难点，其中之一是RPE细胞解除贴壁状态的方法。本专利的消化方法旨在于解决此问题。

发明内容

本发明一方面公开了一种消化酶组合物，包括重组酶TrypLE和中性蛋白酶Dispase II，使用所述酶组合物可以解除RPE细胞的贴壁状态。

其中在一个实施例中，重组酶TrypLE优选为1×TrypLE select。

在另一个实施例中，中性蛋白酶Dispase II的浓度选自0.5mg/mL至4.0mg/mL中的任一浓度，优选选自2.0mg/mL至4.0mg/mL中的任一浓度，更优选为2.0mg/mL。

另一方面，本发明公开了一种消化酶组合物在制备用于解除RPE细胞贴壁状态的试剂或试剂盒中的应用，其中所述消化酶组合物包括重组酶TrypLE和中性蛋白酶DispaseII。

另一方面，本发明也公开了一种消化酶组合物在解除RPE细胞贴壁状态的用途，其中，所述消化酶组合物包括重组酶TrypLE和中性蛋白酶Dispase II。

在一个实施例中，所述中性蛋白酶Dispase II的浓度选自0.5mg/mL至4.0mg/mL中的任一浓度，优选选自2.0mg/mL至4.0mg/mL中的任一浓度，更优选为2.0mg/mL。

另一方面，本发明还公开了一种消化RPE细胞以解除其细胞贴壁状态的方法，包括以下步骤：

(1)使用1×重组酶TrypLE，使其均匀覆盖于RPE细胞；和

(2)使用中性蛋白酶Dispase II溶液，使其均匀覆盖于RPE细胞；