[发明专利]一种重组酶恒温扩增结合免疫胶体金试纸条检测沙门氏菌的试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种重组酶恒温扩增结合免疫胶体金试纸条检测沙门氏菌的试剂盒，所述试剂盒包括沙门氏菌基因引物组DNA、重组酶恒温扩增试剂盒、无菌蒸馏水和核酸免疫胶体金试纸条。本发明试剂盒操作简便，非常适用于现场检测；检测成本低，整个检测过程仅需20min；灵敏度比PCR结合琼脂糖凝胶电泳检测限高104倍，因此其可被广泛用于各种致病菌的检测，能够准确、灵敏、快速地检测沙门氏菌。

技术领域

本发明属于食品检测技术领域，涉及食品中的沙门氏菌检测，尤其是一种重组酶聚合酶恒温扩增结合免疫胶体金试纸条检测沙门氏菌的试剂盒及利用该试剂盒检测沙门氏菌的方法。

背景技术

近年来，由于食品安全事件的频发，世界卫生组织及消费者越来越重视食品安全问题。沙门氏菌是一种革兰氏阴性菌杆菌，在自然界中分布广泛，极易污染肉类、海产品、蛋类等许多食品，消费者食用被沙门氏菌污染的食品就会引发食物中毒。在我国，每年由细菌引起的食物中毒中，沙门氏菌引起的食物中毒居首位，约占40％。检测和鉴定沙门氏菌的方法主要包括传统的细菌培养与生化鉴定和PCR方法。传统培养方法耗时长，大概2-3天，不适合于现场检测。PCR方法操作复杂，需要专门的操作人员和昂贵的热循环装置。这两种检测方法不能满足食品安全检测要求快速、便携、准确、特异性和灵敏度高的要求。

为了适用现场检测的要求，恒温扩增方法得到了广泛的应用，其最大的优点是可以在恒定的温度下发生反应。应用恒温扩增技术检测致病菌，简单的数字水浴锅可以取代昂贵的PCR仪，大大降低了检测成本。恒温扩增方法主要包括环介导等温扩增(LAMP)、滚环扩增(RCA)、解旋酶为基础的扩增(HDA)、重组酶扩增(RPA)。在这些恒温扩增方法中，解旋酶扩增(RPA)以操作简单、反应温度低(37℃-42℃)、扩增所需时间短(5-25min)而优于其他的恒温扩增方法。重组酶扩增是通过模拟DNA体内扩增，利用重组酶、单链结合蛋白和链置换DNA聚合酶，将目标DNA扩增数十亿倍。重组酶能够不通过加热就解开双链DNA。RPA反应开始的时候，重组酶结合单链DNA(引物)，形成核酸蛋白复合体。这些复合体能够扫描与引物序列互补的目标双链DNA。接着，核酸蛋白复合体侵入5'端位点形成D状环。单链结合蛋白与被置换单链结合使其稳定。同时，重组酶离开寡核苷酸的3'端，降解后被DNA聚合酶利用。之后，链置换DNA聚合酶结合在核酸蛋白复合体的游离3'端，进行链延伸，形成新的互补链。在链延伸的过程中，新合成的单链与原始互补链配对。以上步骤循环进行，就可以实现DNA的指数增长。

传统检测恒温扩增产物的方法是使用琼脂糖凝胶电泳，该方法耗时长，并且需要凝胶成像系统，不符合食源性致病菌现场检测简便、快速的要求。胶体金免疫检测试纸条是20世界90年代发展起来的一项新型体外诊断技术。试纸条制作简单，价格便宜，使用方便，并且保存期长。目前关于将试纸条与重组酶恒温扩增结合起来检测沙门氏菌的分析方法未见报道。该技术操作简单快速，结果容易判定，无需复杂的仪器和专业的技术人员，具有很强的现场应用价值。

通过检索，尚未发现与本发明申请相关的专利公开文献。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足之处，提供一种重组酶恒温扩增结合免疫胶体金试纸条检测沙门氏菌的试剂盒及利用该试剂盒检测沙门氏菌的方法，该试剂盒具有高灵敏度、高特异性、可视化、操作简单、便携式的特点。

本发明解决其技术问题是采取以下技术方案实现的：

一种重组酶恒温扩增结合免疫胶体金试纸条检测沙门氏菌的试剂盒，所述试剂盒包括沙门氏菌基因引物组DNA、重组酶聚合酶恒温扩增试剂盒、无菌蒸馏水和核酸免疫胶体金试纸条：

其中，所述沙门氏菌基因引物组DNA为沙门氏菌恒温扩增的正向引物和反向引物，所述正向引物序列为SEQ1：5’-digoxinCTACAAGCATGAAATGGCAGAACAGCGTCG-3’，所述反向引物序列为SEQ2：5’-biotin-CAACCAGATAGGTAGGTAATGGAATGACGA-3’；