[发明专利]一种重组酶恒温扩增结合免疫胶体金试纸条检测沙门氏菌的试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种重组酶恒温扩增结合免疫胶体金试纸条检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒包括沙门氏菌基因引物组DNA、重组酶聚合酶恒温扩增试剂盒、无菌蒸馏水和核酸免疫胶体金试纸条：

其中，所述沙门氏菌基因引物组DNA为沙门氏菌恒温扩增的正向引物和反向引物，所述正向引物序列为SEQ1：5’-digoxinCTACAAGCATGAAATGGCAGAACAGCGTCG-3’，所述反向引物序列为SEQ2：5’-biotin-CAACCAGATAGGTAGGTAATGGAATGACGA-3’；

所述核酸免疫胶体金试纸条包括PVC背板、样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，所述PVC背板沿水平方向设置，该PVC背板上由左至右依次相连接设置样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，各部分在相邻处重叠设置，所述硝酸纤维素膜上沿水平方向平行间隔设置检测线和质控线，所述检测线和质控线沿纵向设置，所述检测线处的硝酸纤维素膜上包被设置链霉亲和素，所述质控线处的硝酸纤维素膜上包被设置兔抗鼠二抗，所述结合垫上包被设置高辛抗体-胶体金标记物；

所述核酸免疫胶体金试纸条在使用过程中，质控线若无颜色，证明该核酸免疫胶体金试纸条失效。

2.根据权利要求1所述的重组酶恒温扩增结合免疫胶体金试纸条检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于：所述核酸试纸条的制备方法如下：

⑴采用柠檬酸三钠还原法制备胶体金；

⑵取1ml步骤⑴中的胶体金加入到无菌离心管中，将1mg/ml鼠抗地高辛单克隆抗体10ul加入到上述胶体金中，制得抗地高辛抗体-胶体金标记物；

⑶将步骤⑵中制备抗地高辛抗体-胶体金标记物包被于结合垫上；

⑷在试纸条的硝酸纤维素膜上包被链霉亲和素作为检测线，并将兔抗鼠二抗包被在硝酸纤维素膜上作为质控线；试纸条使用过程中，质控线若无颜色，证明试纸条失效；

⑸在PVC背板上按顺序粘贴样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜、吸水纸，即得核酸免疫胶体金试纸条。

3.根据权利要求2所述的重组酶恒温扩增结合免疫胶体金试纸条检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于：所述样品垫和硝酸纤维素膜购自美国Millipore公司，所述结合垫、吸水纸和PVC背板购自上海金标生物科技公司，所述链霉亲和素购自sigma公司，所述鼠抗地高辛单克隆抗体和兔抗鼠多克隆抗体购自Abcam公司。

4.根据权利要求2所述的重组酶恒温扩增结合免疫胶体金试纸条检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于：所述胶体金的制备方法如下：

采用柠檬酸三钠还原氯金酸法制备胶体金：

先取200ml去离子水倒入三角烧瓶中，于恒温电磁力搅拌器上加热至沸腾一分钟，清洗三角烧瓶，之后倒掉沸水；取99ml去离子水到三角烧瓶中，取1ml的质量浓度为1％的HAuCl4到上述99ml的去离子水中，加热至沸腾；沸腾后，快速加入2.25ml质量浓度为1％的柠檬酸三钠溶液，2min内可以观察到明显的颜色变化；当胶体金颜色呈现酒红色并且保持不变后，继续加热15min，之后室温下冷却后保存于棕色广口瓶中，4℃保存备用；制备好的胶体金溶液清亮透明，表面无漂浮物。

5.根据权利要求1所述的重组酶恒温扩增结合免疫胶体金试纸条检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于：所述重组酶聚合酶恒温扩增试剂盒购于TwistDx Ltd.Babraham,UK公司。

6.根据权利要求1所述的重组酶恒温扩增结合免疫胶体金试纸条检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于：所述重组酶聚合酶恒温扩增试剂盒能够扩增检测核酸分子，扩增片段的长度为188bp，目标DNA的浓度≥20fg。

7.根据权利要求1所述的重组酶恒温扩增结合免疫胶体金试纸条检测沙门氏菌的试剂盒，其特征在于：所述重组酶聚合酶恒温扩增试剂盒扩增的温度为39℃，扩增时间为10min。