[发明专利]细胞表型研究用的细胞克隆及其筛选方法和应用

说明书

本发明公开了一种细胞表型研究用的细胞克隆及其筛选方法和应用。该细胞表型研究用的细胞克隆的筛选方法可主要用于从未受实验处理的细胞中检索出某种细胞表型的细胞群，其中gRNA条码载体既作为条码，又能作用于检索工具，因而简化了检索和筛选的流程；gRNA‑sensor检索载体本身的第一报告基因不会正常表达，只有与特异性的gRNA条码和用于结合gRNA条码的核酸酶作用后才发出信号，因而可以检索过程定性；只要有第一报告基因相关的信号，就能被捕捉到，从而易于筛选获得阳性细胞克隆。筛选出的阳性细胞可以用于单个研究其有应答或表型形成的能力，可广泛应用在研究细胞表型或在制备用于研究细胞表型的试剂中。

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其是涉及一种细胞表型研究用的细胞克隆及其筛选方法和应用。

背景技术

在生物体内，细胞会有不同的表型，研究其出现不同表型的根本原因是非常重要的。以癌细胞为例，在癌症患者中，肿瘤细胞群会表现出不同的表型，如有的肿瘤细胞能增殖，有的会迁移，还有些具有抗药性等，这些不同表型是癌症研究进展和治疗反应中出现许多不可预测性的主要原因，因此了解肿瘤发生的基本生物学对于改善治疗结果是非常重要的。肿瘤细胞具有不同表型的根本原因可以归因于两个相互非排他性的可能性：一是患者内所有肿瘤细胞具有相同的内在表型潜力，但患者机体本身或用药过程中存在很多因素变量等随机原因使得只有部分肿瘤细胞表现出了某种表型；二是患者的肿瘤细胞群体在其遗传和表观遗传学上是异质性的，注定只有部分细胞表现出相应的表型。传统的有一些用于研究不同细胞群(如肿瘤细胞)出现不同表型的原因的方法，如专利CN102203281A，其制作条码克隆的工具是慢病毒过表达载体，通过在报告基因的5’UTR或3’UTR上放置10个碱基长的随机条码，理论上会有4¹⁰种组合，其使用的检索工具是慢病毒shRNA干扰载体，对制作条码工具上的报告基因进行特异性打靶，从而筛选出荧光报告基因变弱的目的细胞。然而传统的研究方法普遍存在诸多问题，如使用shRNA干扰载体工具来检索条码，报告基因检测信号是由强变弱的过程，而有些细胞在生长传代过程中由于生长条件等外在因素的改变而易使本身的荧光有变弱的倾向，较易混杂阴性细胞，不利于观察和筛选；并且要想进一步剔除混杂细胞，要使用强力霉素再次筛选，对细胞又进行多一次处理，操作复杂的同时又可能影响了细胞的原始特性；此外，检索过程是定量的过程，不易检索出那些含有多个拷贝条码载体的细胞。

发明内容

基于此，有必要提供一种易于观察和筛选且检索效率高、检索结果可靠的细胞表型研究用的细胞克隆及其筛选方法和应用。

一种细胞表型研究用的细胞克隆的筛选方法，包括如下步骤：

步骤一：构建gRNA条码载体，所述gRNA条码载体具有表达用作标记条码的gRNA的表达框，所述gRNA条码载体有多种，且不同的gRNA条码载体中gRNA编码片段的序列不同，多种所述gRNA条码载体构成gRNA条码载体库；

步骤二：将所述gRNA条码载体库转导待研究的细胞，得到由多种含不同gRNA编码片段的细胞构成的细胞群，将所述细胞群分成实验组和预留组；

步骤三：对所述实验组的细胞群进行实验处理，筛选具有特定表型的实验组阳性细胞，获取所述实验组阳性细胞中与所述特定表型相对应的特定的gRNA编码片段的序列；

步骤四：针对获取的特定的gRNA编码片段的序列，构建特异性的gRNA-sensor检索载体，所述gRNA-sensor检索载体的表达框中含有第一报告基因以及插入在所述第一报告基因中的左同源臂、特定的gRNA编码片段、PAM和右同源臂，所述左同源臂与所述右同源臂与所述第一报告基因的部分序列片段同源；

步骤五：将构建的特异性的gRNA-sensor检索载体与能够表达用于结合gRNA条码的核酸酶的载体共同转导预留组的细胞群后，根据所述第一报告基因的表达情况筛选出阳性细胞，即得。