[发明专利]细胞表型研究用的细胞克隆及其筛选方法和应用

权利要求书

1.一种细胞表型研究用的细胞克隆的筛选方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一：构建gRNA条码载体，所述gRNA条码载体具有表达用作标记条码的gRNA的表达框，所述gRNA条码载体有多种，且不同的gRNA条码载体中gRNA编码片段的序列不同，多种所述gRNA条码载体构成gRNA条码载体库；

步骤二：将所述gRNA条码载体库转导待研究的细胞，得到由多种含不同gRNA编码片段的细胞构成的细胞群，将所述细胞群分成实验组和预留组；

步骤三：对所述实验组的细胞群进行实验处理，筛选具有特定表型的实验组阳性细胞，获取所述实验组阳性细胞中与所述特定表型相对应的特定的gRNA编码片段的序列；

步骤四：针对获取的特定的gRNA编码片段的序列，构建特异性的gRNA-sensor检索载体，所述gRNA-sensor检索载体的表达框中含有第一报告基因以及插入在所述第一报告基因中的左同源臂、特定的gRNA编码片段、PAM和右同源臂，所述左同源臂与所述右同源臂与所述第一报告基因的部分序列片段同源；

步骤五：将构建的特异性的gRNA-sensor检索载体与能够表达用于结合gRNA条码的核酸酶的载体共同转导预留组的细胞群后，根据所述第一报告基因的表达情况筛选出阳性细胞，即得。

2.如权利要求1所述的细胞表型研究用的细胞克隆的筛选方法，其特征在于，所述构建gRNA条码载体是将所述gRNA编码片段插入在具有自杀基因的载体中，替换自杀基因。

3.如权利要求1所述的细胞表型研究用的细胞克隆的筛选方法，其特征在于，所述gRNA编码片段的两端还分别连接有保护序列片段和/或酶切位点识别片段。

4.如权利要求3所述的细胞表型研究用的细胞克隆的筛选方法，其特征在于，所述gRNA条码的长度为18-23bp；和/或所述保护序列片段的长度为40-50bp。

5.如权利要求1所述的细胞表型研究用的细胞克隆的筛选方法，其特征在于，所述gRNA条码载体还具有第二报告基因的表达框。

6.如权利要求1～5中任一项所述的细胞表型研究用的细胞克隆的筛选方法，其特征在于，每个待研究的细胞转导有一种或两种gRNA条码载体。

7.如权利要求1～5中任一项所述的细胞表型研究用的细胞克隆的筛选方法，其特征在于，所述左同源臂和/或所述右同源臂的长度为180-300bp。

8.如权利要求1～5中任一项所述的细胞表型研究用的细胞克隆的筛选方法，其特征在于，所述能够表达用于结合gRNA条码的核酸酶的载体为能够表达Cas9或saCas9核酸酶的载体。

9.采用如权利要求1～8中任一项所述的细胞表型研究用的细胞克隆的筛选方法筛选得到的细胞克隆在研究细胞表型或在制备用于研究细胞表型的试剂中的应用。