[发明专利]双靶向配体化力达霉素DTLL的制备工艺改进和质量标准制定

说明书

本发明涉及免疫融合蛋白DTLP的和双靶向配体化力达霉素DTLL的制备工艺改进和质量标准制定，主要包括：筛选高产的转化宿主菌株、改变发酵菌体起始密度，缩短诱导后发酵时间等表达条件；改用压力破碎法破碎菌体提取总的可溶性蛋白，大大提升了目的融合蛋白的提取产率；进行目的融合蛋白的中试发酵条件优化，为工业化规模生产提供前期数据和参考标准；优化了制备工艺，针对细菌内毒素进行去除，对冻干样品的稳定性进行了有效监测。

技术领域：

本发明涉及生物制药领域，具体涉及新型抗肿瘤靶向药物的制备工艺方法改进和符合临床申报要求的更高质量控制标准的药物产品。

背景技术：

力达霉素(Lidamycin，LDM)也称C-1027，是从我国湖北省潜江县土壤中分离得到的一株链霉菌(Streptomyces globisporus，菌种保藏号：CGMCC No.0704)产生的烯二炔类抗生素，是迄今报道过的对肿瘤细胞杀伤作用最强的大分子肽类抗肿瘤抗生素。体内动物试验表明，LDM对小鼠结肠癌26有非常显著的疗效，对人肝癌Bel-7402和盲肠癌Hce-8693等多种人移植瘤均有较好疗效[中国抗生素杂志1994，19(2)：164-168]。LDM由辅基蛋白(LDP)和烯二炔结构的发色团(AE)两部分组成，发色团是力达霉素分子的活性部分，辅基蛋白对发色团起稳定保护作用。LDM的发色团和辅基蛋白系通过非共价键结合，因而可在体外将其拆分与重建。LDM以其独特的分子结构，成为构建新型导向药物的理想“弹头”[中国医学科学院报2001，23(6)：563-567]。

本研究所根据力达霉素的结构和生物学特性,前期构建并制备了抗肿瘤治疗作用的双特异性寡肽-力达霉素强化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE(专利公开号：CN101497666A)。该强化融合蛋白Ec-LDP-Hr-AE由靶向EGFR的寡肽、力达霉素辅基蛋白、靶向HER2的寡肽以及力达霉素活性发色团四部分组成。前期的体内外试验初步证实，同LDM相比，其可特异性靶向肿瘤细胞而发挥高效抗肿瘤活性[Clin Cancer Res.2010Apr 1；16(7):2085-94]。

然而,之前的强化融合蛋白制备方法具有以下缺点和不足：采用渗透压震惊法提取细菌周质腔蛋白，每升发酵液提取融合蛋白低于10mg，产率低不适合于大规模工业发酵制备；融合蛋白Ec-LDP-Hr纯度较低，仅达到95.3％；缺乏融合蛋白Ec-LDP-Hr与LDM发色团的组装效率检测，不利于不同批次间产品质量差异的控制；融合蛋白产品未经去除内毒素处理；对产品稳定性未进行有效监测及制定客观精准的质量控制标准。这制约着产品的工业化制备，难以符合临床申报所需的高质量控制标准的要求，影响未来药物产品的临床应用。

为了解决上述问题，发明人在上述专利申请涉及的强化融合蛋白的基础上进行系统的制备工艺条件的优化，主要包括(1)筛选高产的转化宿主菌株、改变发酵菌体起始密度，缩短诱导后发酵时间等表达条件；(2)通过表达定位分析、氨基酸测序验证以及表达定量分析表明，每升发酵液最高可获得约30mg目的蛋白；(3)改用压力破碎法破碎菌体提取总的可溶性蛋白，大大提升了目的融合蛋白的提取产率；(3)将镍柱亲和纯化蛋白经过purifier凝胶层析再次纯化，大大提高了目的蛋白纯度(99.7％)，利于后续试验和药品质控；(4)进行目的融合蛋白的中试发酵条件优化，为工业化规模生产提供前期数据和参考标准；(5)优化了制备工艺，对分离发色团所得的含量和组装效率进行定量检测，并制定制备工艺标准；(6)针对细菌内毒素进行去除，使产品符合注射剂的内毒素含量标准；(7)对冻干样品的稳定性进行了有效监测。从而，对多项制备工艺步骤进行改进和客观分析评估，更符合临床申报所需的高质量控制标准的要求。

本发明中将作为药物的中间产品的免疫融合蛋白命名为DTLP，其为SEQ ID药物NO.1所示序列编码的蛋白质，将作为最终产品的双靶向配体化力达霉素命名为DTLL，其为SEQ ID药物NO.1所示序列编码的蛋白质与下述化学式(I)所示的发色团的组装产物。

发明内容