[发明专利]一种富集人血液MNCs的方法

说明书

本发明公开了一种富集人血液MNCs的方法，包括以下步骤：S1：采集血样本；S2：通过血样本离心后吸出富集单个核细胞MNCs；S3：富集MNCs利用密度梯度离心法分离得到MNCs。本发明有益效果：不仅能够减少铺管和移液操作量，而且能减少淋巴细胞分离液使用量，最终有效降低劳动强度和制备成本。

技术领域

本发明涉及细胞培养技术领域，具体来说，涉及一种富集人血液MNCs的方法。

背景技术

单个核细胞(Mononuclear cells，以下简称MNCs)是不分叶的单核细胞，一般指脐带血、胎盘血、骨髓、外周血中的淋巴细胞、单核巨噬细胞。事实上，血液中MNCs的成分十分复杂，不同组织来源的MNCs包含不同比例的造血干/祖细胞、间充质干细胞、神经前体细胞、内皮前体细胞、内皮细胞、多潜能干细胞、小胚胎样细胞等。因此，人血液MNCs在再生医学和组织工程领域的应用十分广阔。随着脐带血移植、免疫细胞治疗技术的发展，脐带血、外周血MNCs的分离方法受到广泛重视。

目前，个体化分离脐带血、外周血MNCs的方法常用密度梯度离心法，其原理在于血液中红细胞和白细胞等细胞密度为1.090g/mL，而MNCs的密度为1.077g/mL，因此采用密度在1.077g/mL的等渗ficoll溶液，经密度梯度离心使不同密度的细胞按密度梯度分布，从而分离MNCs，其中，密度梯度离心法分离MNCs分为几个步骤：首先将抗凝血与缓冲液1:1混匀，然后小心铺在分离液液面上，400g水平离心20分钟，取中间第二层环状乳白色MNCs层，洗涤2次，收取沉淀即可。其他诸如脐带血、骨髓MNCs的密度梯度分离方法以及其他品牌的ficoll或淋巴细胞分离液的操作方法也与此类似。

对于实验室条件下少量血液MNCs分离可以不追求工作效率和操作难度，对于超过100mL的血液MNCs分离而言，按照说明书的方法，我们核算样本量、分离液量以及操作时间：血液样本100mL，稀释后时200mL；分离液量需要160mL(8支50mL尖底离心管，20mL/支)；铺管约2.5分钟/支，离心约20分钟，洗涤约30分钟，共计70分钟。因此，批量制备血液MNCs是比较耗时、耗力，且成本较高。

针对相关技术中的问题，目前尚未提出有效的解决方案。

发明内容

针对相关技术中的上述技术问题，本发明提出一种富集人血液MNCs的方法，不仅能够减少铺管和移液操作量，而且能降低分离液使用量，最终有效降低劳动强度和制备成本。

为实现上述技术目的，本发明的技术方案是这样实现的：

一种富集人血液MNCs的方法，包括以下步骤：

S1：采集脐带血或外周血样本；

S2：通过脐带血或外周血样本离心后吸出富集单个核细胞MNCs；

S3：富集MNCs利用密度梯度离心法分离得到MNCs。

进一步地，所述步骤S2进一步包括如下步骤：将脐带血或外周血样本转移至50ml离心管离心，其中，50ML离心管中由上到下分为两层，下层为细胞层，上层为血浆层，距离血浆层1cm至距离细胞层0.5cm之间的血浆层和细胞层为富集MNCs层，以无菌巴氏吸管吸出富集MNCs，合并细胞悬液。

进一步地，所述步骤S3进一步包括如下步骤：在50ml离心管中加入淋巴分离液20ml，将富集MNCs以生理盐水定容至25ml，铺到淋巴细胞分离液液面上，25ml/支，取400g水平离心20分钟，吸出中间环状白膜层，以生理盐水洗涤2次，收集沉淀细胞。

进一步地，所述脐带血或外周血样本为血量和抗凝剂之和。

进一步地，脐带血或外周血样本的提供者无乙肝、丙肝、梅毒、HIV-I/II病毒感染，无细菌、支原体感染，采集后行CD34表型检测、淋巴细胞计数检验。