[发明专利]一种牛种布氏菌弱毒疫苗株S19的检测方法

说明书

本发明提供一种种牛种布氏菌弱毒疫苗株S19的检测方法和检测用的引物组，其中所使用的引物组的序列为SEQ ID NO:1‑4。本发明引物组及方法的优点如下：1)高效灵敏：30min即可完成扩增，扩增模板的最低检出限为1.0×10‑3ng/μl；2)特异性强：采用两对PRA引物组特异性对S19进行鉴别检测，与其他种、生物型的布氏菌、布氏菌疫苗株及常见非布氏菌株，无交叉反应；3)操作简便：配置好的RPA反应体系，置于39℃恒温条件下完成反应，不需要使用PCR仪；4)高通量：可在水浴或恒温培养箱中一次性进行大量样品检测，不受PCR仪设备检测孔数量限制。

技术领域

本发明属于微生物检测技术领域，具体涉及一种牛种布氏菌弱毒疫苗株S19的重组酶聚合酶扩增技术(recombinase polymerase amplification， RPA)快速鉴别方法。

背景技术

布氏菌病(简称布病)是由布氏菌引起的全球广泛流行的人兽共患传染病，对畜牧业及公共卫生安全造成严重威胁。近年来我国布病疫情防治形势严峻，呈现由牧区向非牧区转移，由职业人群向非职业人群扩散的趋势。对家畜进行弱毒疫苗免疫能遏制布病向人间传播，但弱毒疫苗的免疫会对布病的诊断和监测造成干扰。实现布氏菌弱毒疫苗株与野生型菌株的鉴别，对于布病防控工作具有重要意义。

布氏菌S19株是国际上广泛应用的布氏菌弱毒疫苗株之一，也是世界动物卫生组织(OIE)推荐的弱毒疫苗株。S19株能持续刺激机体产生抗体，广泛应用于牛的免疫接种。S19株属于光滑型布氏菌，含有LPS脂多糖，动物免疫后产生的抗体无法与自然感染相区分，给布病诊断带来困难。而布氏菌分离鉴定需要在生物安全三级实验室进行，且耗时长，对人员和设备要求较高。

分子生物学技术的发展，为S19株的快速鉴别提供了手段，国际上已先后建立基于PCR和荧光定量PCR方法鉴别S19株的方法。RPA是近年一种新开发的恒温核酸扩增技术，该方法能在36～40℃恒温条件下于20min 内大量扩增目的基因以完成检测，具有特异性强、灵敏度高、反应速度快、操作简便等优点。与常规的PCR和荧光定量PCR方法相比，PRA反应条件为恒温，不需要进行变性、退火、延伸循环，对实验仪器设备依赖少且反应速度快，特别适用于现场检测。目前该技术已经在一些病原快速检测方面得到应用，但还没有基于RPA技术鉴别S19株的检测方法。

发明内容

本发明的目的是提供一种牛种布氏菌弱毒疫苗株S19的RPA快速鉴别检测方法，从而弥补现有布氏菌检测技术的不足。

本发明首先提供一组用于鉴别S19株的RPA引物组，引物信息如下：

Omp2-F:CGTGCGGCATGTAACCGTCGATCGTGTAATC(SEQ ID NO:1)、

Omp2-R:TGCATATATCACGCTTGGTGGTTTCAAGGTT(SEQ ID NO:2)、

S19E-F:CGCTAACCCGGACGACTACGATCCTTACGCAT(SEQ ID NO:3)、

S19E-R:GGCAGATTTCATTATCCACCGCGCCGCCTTC(SEQ ID NO:4)；

本发明还提供一种利用上述RPA引物组检测S19株的方法，包括如下的步骤：

1)待检测基因组DNA的提取：用细菌基因组DNA提取试剂盒 (QIAGEN公司)提取细菌DNA；

2)RPA步骤：将本发明设计RPA引物组及各反应组分，分别加入反应体系中，39℃反应30min。

3)结果检测：回收纯化RPA反应产物，2％琼脂糖凝胶电泳检测，判定检测结果。

另一方面，本发明的RPA引物组可用于制备检测试剂盒。