[发明专利]基于高通量测序的三段式探针扩增方法

说明书

本发明提供了一种基于高通量测序的三段式探针扩增方法，包括如下步骤：(1)基因组DNA的杂交和连接；(2)PCR扩增反应；(3)Qubit测浓度，Qseq看条带大小，二代测序。本申请的方法可以用10元试剂成本检测至少200个SNP位点，检测成本节约，检测结果的准确度大于98％以上。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种基于高通量测序的三段式探针扩增方法。

背景技术

多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probeamplification，MLPA)于2002年由Schouten等首先报道，是近几年发展起来的一种针对待检DNA序列进行定性和半定量分析的新技术。传统的MLPA是一种检测遗传性疾病基因缺失和重复突变的髙通量有效新技术，能对DNA序列进行定性和半定量分析，这一特点使得该技术在检测单核苷酸多态性(SNP)和点突变，染色体的非整倍性改变，以及几种常见的儿童遗传病如智力低下综合征，X连锁型智力低下，假肥大型肌营养不良症等。一种基于高通量测序的SNP检测方法的技术方案：探针设计，预扩增及biotin标记，杂交，连接，Barcode特异性引物扩增，测序，根据测序结果来分析样品的SNP位点信息。一种基于MLPA的基因拷贝数和突变的高通量测序检测方法：在MLPA技术环节中，对PCR扩增环节或其前后环节进行改造，使PCR产物带有可进入高通量测序的接头序列并上机测序。对所得数据分析后获得每个探针扩增的Reads数，进以计算模板拷贝数或基因突变情况。接头序列中可置入用于区分不同样本的标签序列，因而本技术在确保检测拷贝数的高精确性的同时，实现了检测位点的高通量性和检测样本的高通量性。毛细管电泳不能区分长度相同或相近的片段，产物设计不能一样长，因而每次只能检测有限的位点数，同时长探针的制备较为复杂而且合成成本高，出错率提高。传统的两段式MLPA技术检测的准确度和灵敏性以及数据的可靠性与本发明中的三段式探针连接扩增技术相比存在错误率高、灵敏性差、成本高。传统的MLPA技术需要杂交、连接分步操作，而本技术将杂交和连接同时反应完成。

发明内容

本发明提供了一种基于高通量测序的三段式探针扩增方法，通过探针人工设计合成，探针与变性模板杂交，杂交后探针的连接，PCR扩增，最后用高通量测序的方法对其检测达到基于诊断的目的。

本发明的目的是通过以下方案实现：

一种基于高通量测序的三段式探针扩增方法，包括如下步骤：

(1)基因组DNA的杂交、连接并纯化；

(2)PCR扩增反应；

(3)Qubit测浓度，Qseq看条带大小，二代测序；

所述步骤(1)中杂交的探针包括左探针、右探针和中间探针；所述左探针、右探针和中间探针的序列设计时必需与目标靶序列一条链互补，左探针、右探针和中间探针设计时三者之间不能有缺口。

优选地，所述步骤(1)中的左探针、右探针的长度大小在没有添加通用引物序列时大于23个寡核苷酸，小于50个寡核苷酸；中间探针的长度为5个寡核苷酸序列。

优选地，所述步骤(1)中的左探针的5’端前面添加一段通用序列CCTACACGACGCTCTTCCGATCT；右探针的3’末端添加一段通用序列TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGAAC。

优选地，所述步骤(1)的连接反应的酶包括NEB公司的Taq DNA Ligase、HiFi TaqDNA Ligase、9°N^TM DNA Ligase、E.coli DNA Ligase和QIAGEN Taq DNA Ligase。

优选地，所述步骤(1)中杂交和连接的体系为：

优选地，所述杂交和连接的程序为：

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