[发明专利]基于高通量测序的三段式探针扩增方法

权利要求书

1.一种基于高通量测序的三段式探针扩增方法，其特征在于，包括如下步骤：

(1)基因组DNA的杂交、连接并纯化；

(2)PCR扩增反应；

(3)Qubit测浓度，Qseq看条带大小，二代测序；

所述步骤(1)中杂交的探针包括左探针、右探针和中间探针；所述左探针、右探针和中间探针的序列设计时必需与目标靶序列一条链互补，左探针、右探针和中间探针设计时三者之间不能有缺口；

所述步骤(1)中的左探针、右探针的长度大小在没有添加通用引物序列时大于23个寡核苷酸，小于50个寡核苷酸；中间探针的长度为5个寡核苷酸序列；

步骤(2)PCR扩增反应的探针混合体系中含有左探针0.8ul、右探针0.8ul和中间探针2.4ul。

2.根据权利要求1所述的基于高通量测序的三段式探针扩增方法，其特征在于，所述步骤(1)中的左探针的5’端前面添加一段通用序列CCTACACGACGCTCTTCCGATCT；右探针的3’末端添加一段通用序列TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGAAC。

3.根据权利要求1所述的基于高通量测序的三段式探针扩增方法，其特征在于，所述步骤(1)的连接反应的酶包括NEB公司的Taq DNA Ligase、HiFi Taq DNA Ligase、9°N^TMDNALigase、E.coli DNA Ligase和QIAGEN Taq DNA Ligase。

4.根据权利要求1所述的基于高通量测序的三段式探针扩增方法，其特征在于，所述步骤(1)中杂交和连接的体系为：

5.根据权利要求4所述的基于高通量测序的三段式探针扩增方法，其特征在于，所述杂交和连接的程序为：

94℃5min

60℃90min

4℃∞

上述产物：1x磁珠纯化。

6.根据权利要求1所述的基于高通量测序的三段式探针扩增方法，其特征在于，所述步骤(2)中PCR条件如下：

1)98℃预变性30sec

2)98℃变性10sec

3)55℃退火30sec

4)72℃延伸15sec

2)-4)循环次数30次

5)72℃延伸5min

6)4℃延伸∞

上述产物：1.8X磁珠纯化。

7.根据权利要求6所述的基于高通量测序的三段式探针扩增方法，其特征在于，所述PCR体系为22μl体系，具体如下：

所述4系列引物：

AATGATACGGCGACCACCGAGATCTACAC[i5barcode]ACACTCTTTCCCTACACGACGCTCTTCCGATCT；

所述8系列引物：

CAAGCAGAAGACGGCATACGAGAT[i7barcode]GTGACTGGAGTTCCTTGGCACCCGAGAATTCCA。