[发明专利]一种苯二氮卓免疫检测试剂及其制备和检测方法

权利要求书

1.一种苯二氮卓免疫检测试剂及其制备和检测方法，其特征在于：酶标苯二氮卓、用于检测苯二氮卓抗体-酶标苯二氮卓复合物的指示试剂。

2.根据权利要求1所述的苯二氮卓的免疫检测试剂，其特征在于：所述酶标苯二氮卓由苯二氮卓和葡萄糖脱氢酶偶联而成。

3.根据权利要求1所述的苯二氮卓免疫检测试剂，其特征在于：所述指示试剂选自酶试剂，包括：酶标偶联物和酶的底物；上述酶标偶联物包括葡萄糖脱氢酶-苯二氮卓偶联物；上述酶的底物为葡萄糖。

4.一种苯二氮卓免疫检测试剂及其制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）葡萄糖脱氢酶-苯二氮卓偶联物的制备：苯二氮卓半抗原的制备，葡萄糖脱氢酶（GDH）与苯二氮卓半抗原偶联，纯化偶联的酶标抗原；

（2）苯二氮卓均相酶免疫检测试剂的制备：

试剂1的制备：由苯二氮卓抗体和均相酶底物混合而成；

试剂2的制备：由葡萄糖脱氢酶-苯二氮卓偶联物与磷酸盐缓冲液混合而成。

5.根据权利要求5所述的一种苯二氮卓免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，所述的步骤（1）具体过程为：

1）苯二氮卓半抗原的制备

a. 将1-10 g苯二氮卓溶于10-100 mL无水吡啶中，加入乙酸酐，室温静置12小时以上，减压浓缩，蒸干后称重，得产物A；

b. 用20-100 mL二甲基甲酰胺溶解50-150 g产物A，再加入5-30 mL 浓度为1M的盐酸，室温静置12小时以上，然后用乙醚萃取，收集有机相用氢氧化钠水溶液萃取，继续收集有机相减压浓缩，加入少量石油醚，蒸干得产物B；

c. 取适量产物B溶于乙酸酐中，94℃下反应15-30分钟，冷却结晶过夜，再减压蒸干得产物C；

d. 产物C加入95%乙醇和5M氢氧化钠，得到乳白色悬浊物，加入适量纯化水溶解，用少量乙酸调pH至酸性，析出沉淀后过滤，滤渣干燥过夜，得产物D；

e. 称取100-500 mg产物D溶于2-10 mL无水吡啶中，加入100-500 mg丁二酸酐，95-105℃下反应14小时以上，减压蒸干，用38%碳酸钾溶解，再用乙酸乙酯萃取，收集水相，用盐酸调pH至4.8-5.2，然后用乙酸乙酯萃取，收集有机相，减压蒸干，得到苯二氮卓半抗原；

2）葡萄糖脱氢酶（GDH）与苯二氮卓的偶联

a. 将5-35 mg上述苯二氮卓半抗原溶于500-2000 μL2-(N-吗啡啉)乙磺酸中，轻微振荡溶解；取10-45 mg 规格为100-300 KU的GDH溶解于PBS缓冲液中震荡均匀；

b. 将50-150 μL的碳二亚胺（EDC）溶液在搅拌下缓慢滴加到苯二氮卓半抗原溶液中，旋转混合15-30分钟；

c. 将上述活化好的苯二氮卓溶液在搅拌下缓慢加入到GDH溶液中，搅拌反应1-2小时；

3）纯化偶联的酶标抗原

通过G-25凝胶层析柱纯化偶联的酶标抗原，得到葡萄糖脱氢酶-苯二氮卓偶联物，于2-8℃下储存。

6.根据权利要求5所述的一种苯二氮卓免疫检测试剂的制备方法，其特征在于，步骤（2）的具体过程如下：

试剂1的制备：将2-5 g氧化态的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸NAD、0.5-3 g葡萄糖用0.5-2L磷酸盐缓冲液溶解制成均相酶底物；将苯二氮卓抗体加到上述均相酶底物中，抗体与均相酶底物的体积比为1:100～1:10000；

试剂2的制备：将制备的葡萄糖脱氢酶-苯二氮卓偶联物加到磷酸盐缓冲液中，上述偶联物与磷酸盐缓冲液的体积比为1:100～1:10000。

7.利用权利要求1至4任意一项所述的苯二氮卓免疫检测试剂的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：

1）将待测样本与苯二氮卓抗体接触；

2）根据待测样本中苯二氮卓与苯二氮卓抗体的结合情况，利用指示试剂判断样本中苯二氮卓的含量；所述待测样本为血清、血浆、唾液或尿液。