[发明专利]一种同时检测多种A组人类肠道病毒的引物组合及其应用

说明书

本发明涉及一种同时检测多种A组人类肠道病毒的引物组合及其应用。该引物组合包括：引物对1—4，其序列分别如SEQ ID No.1和2、SEQ ID No.4和5、SEQ ID No.7和8、SEQ ID No.10和11；还可包括检测探针，优选为特异探针1—4；引物对及特异探针分别用于检测A组人类肠道病毒CVA6、CVA10、CVA16、和/或EV71。本发明设计的特异性引物对1—4及探针1—4对于四型病毒CVA6、CVA10、CVA16和EV71可实现单重及多重特异性检测，其特异性强、灵敏性高、重复性及稳定性好，对于临床上可快速检测且分型，实现一检定型的效果。本发明具有很强的临床实践意义，使得临床治疗更加及时有效，同时对于手足口病的防控也有重要的意义。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体说是一种同时检测多种A组人类肠道病毒的引物组合及其应用，尤其涉及检测多种A组人类肠道病毒的试剂盒。

背景技术

人类肠道病毒(HEV)是一类在人类肠道繁殖的常见病毒。按血清型分为脊髓灰质类病毒(Poliovirus,PV 1-3型)、柯萨奇病毒(Coxsackievirus)A型(CVA 1-22和24型)、柯萨奇病毒B型(CVB 1-6型)、埃可病毒(Echovirus，ECHO 1-7、9、11-27、29-33型)。随着分子生物学技术与生物信息学技术的应用，根据生物学及遗传特性，HEV被重新划分为A、B、 C、D共4个基因组，其中，HEV-A(A组人类肠道病毒)包括17个基因型，即CVA 2-8、 10、12、14、16、EV71、EV76、EV89-92。

手足口病(Hand，foot and mouth disease，HFMD)是由肠道病毒感染而导致的一种良性自限性急性传染性疾病，多发于6岁以下儿童，其特征是发热、口腔黏膜溃疡、手足臀部斑疹或斑丘疹；个别患者可引起心肌炎、肺水肿、无菌性脑脊髓膜炎、脑炎等并发症，致死、致残率很高，不仅影响患者的生存质量，而且占用耗费着极大的医疗卫生资源，财政支出巨大。HFMD曾在许多国家和地区多次流行，在我国，HFMD自1981年在上海出现以来，相继出现在北京、天津、福建等地。自从2008年3月份安徽阜阳出现疫情以来，几乎波及中国大陆所有省份和地区，在我国HFMD感染人数和死亡人数呈逐年上升趋势。自2012年起，在国内外很多地区HFMD的肠道病毒A组71型(EV71)和柯萨奇病毒A组16型(CVA16) 不再是优势流行株。其他肠道病毒如柯萨奇病毒A组6型(CVA6)和柯萨奇病毒A组10型 (CVA10)所占比例越来越高。2008年，芬兰爆发了以CVA6和CVA10型为主的手足口病。 2010年法国手足口致病病原调查中，CVA6和CVA10型的比例大大超过EV71和CVA16。

柯萨奇病毒和EV71型手足口病临床症状很难区分，且多伴行爆发流行，故临床上急需一种可快速精确分型的检测方法，为临床上的个体化治疗提供了可靠的依据。目前对于肠道病毒的诊断方法有病毒分离培养法、血清学方法、以及普通的RT-PCR方法。而病毒培养法相对耗时且需要专门技术人员；血清学方法灵敏度相对较低；普通RT-PCR检测法易污染且只能定性检测。而荧光定量PCR技术具有灵敏性高、特异性强、便捷快速等特点，是目前较为理想的诊断技术。多重荧光定量PCR使用多条引物在一个反应管中进行多种核酸的扩增，实现多重病原体的同步检测，与常规RT-PCR(即普通PCR)相比，具有绝对的优势。

发明内容

针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种同时检测多种A组人类肠道病毒的引物组合及其应用，所述A组人类肠道病毒包括：CVA6、CVA10、CVA16和EV71。本发明具有特异性强、灵敏性高、重复性及稳定性好的特点，临床上对上述四种肠道病毒可进行快速检测且分型。

一方面，本发明提供了检测A组人类肠道病毒的引物对，所述引物对包括引物对1-4。

其中，引物对1可用于检测柯萨奇病毒A组6型(CVA6)，其上游引物如SEQ ID No.1所示，下游引物如SEQ ID No.2所示；