[发明专利]一种脐带组织复苏后分离和扩增干细胞的方法及其培养基

说明书

本发明涉及一种脐带组织复苏后分离和扩增干细胞的方法及其专用培养基，包括脐带组织复苏、组织块获得、分离原代干细胞和扩增传代干细胞步骤，其中，使用消化液为含有的Ⅱ型胶原酶、TrypLE^TM express和脯氨酞氨基酸的氯化钠注射液，使用的培养基为包含硒酸钠、牛转铁蛋白、鸟氨酸、5‑7mg/ml植物血凝素、α‑生育酚琥珀酸单酯、IL‑6、LIF和HGF的DMEM/F12培养基。本发明所提供的分离培养方法，人脐带间充质干细胞爬出时间短，原代干细胞培养周期短，得到的干细胞纯度高，活性好，可进行多次传代，多次传代后得到的干细胞依然具有高度分化的潜能。

技术领域

本发明属于细胞培养领域，特别涉及一种脐带组织复苏后分离和扩增干细胞的方法及其专用培养基。

背景技术

由于人脐带间充质干细胞hUCMSCs)具有自身独特的优点和特性，且含量丰富，取材容易，是目前研究较为广泛的人源干细胞，hUCMSCs的分离培养方式也日益便利和完善，常规的方法即为将取得的人脐带进行初步的处理，进行冻存，然后在需要时，将冻存的人期待进行干细胞分离与培养，通常原代干细胞主要是以酶消化法，或组织块法获得，酶消化法可以在短时间获得细胞，但是获得的细胞具有较多杂质，经多次传代才可以纯化，且消化时间难以掌控，对细胞的损害较大；而组织块法具有培养周期长，得到的细胞数量少，得到的原代干细胞传代能力差等缺点；如何获得大量稳定或利好的细胞是人脐带间充质干细胞培养的难点。另一方面，在细胞的体外培养过程中，大多数研究者仍然采用经典培养基加入胎牛血清进行干细胞培养，然而，异种血清存在这一定的安全隐患，对hUCMSCs的临床应用造成一定的局限。

且扩增后细胞按照国际细胞治疗协会(ISCT)提出的最低标准进行了鉴定,即人脐带间充质干细胞必须满足三条才可以被认为是人脐带间充质干细胞。首先细胞必须是贴壁生长；其次人脐带间充质干细胞必须表达CD90、CD105、CD73等间充质细胞的特异性标记，而不表达造血系或内皮系细胞的标记：CD45，CD14，CD19，CD34及主要组织相容性抗原HLA-DR；再次必须具有分化为骨、软骨、脂肪细胞的多向分化潜能。

发明内容

本发明的特征在于在前人研究的基础上，提供了一种脐带组织复苏后分离和扩增干细胞的方法，具体技术方案如下：

1)脐带组织复苏：取出冻存脐带组织的冻存管，放置于37℃水浴中解冻，解冻完毕后，采用复苏缓冲液洗涤3-5次，得到复苏后脐带组织；

2)组织块获得；将步骤1)所得的复苏脐带组织切成1mm³组织块，加入消化液于15℃消化1-2h，然后在37℃消化5-10min,终止消化，移除消化液及悬浮细胞，获取未消化组织块，于氯化钠注射液中漂洗，离心弃上清，得剩余组织块；其中，所述消化液为含有0.5-0.7mg/ml的Ⅱ型胶原酶、0.1-0.2mg/ml的TrypLE express和0.3-0.5mg/ml脯氨酞氨基酸的氯化钠注射液；

3)分离原代干细胞：将剩余组织块放置于培养皿中，相邻剩余组织块之间间隔15-20mm，将培养皿放置于37℃培养箱中静置10min,然后向培养皿中加入培养基，保证剩余组织块能完全浸润在培养基中；每天半数换液，培养2天后，将剩余组织块移入新培养皿，更换培养基，保证剩余组织块浸润却不悬浮，然后继续培养，待细胞融合至80-90％，收获原代干细胞；

4)扩增传代干细胞：取步骤3)得到的原代干细胞，重悬于培养基中，按照4-5×10⁴个/mL的浓度，在37.0±0.5℃的温度、5.0±0.2％的CO₂浓度和饱和湿度的条件下进行传代培养。