[发明专利]一种脐带组织复苏后分离和扩增干细胞的方法及其培养基

权利要求书

1.一种脐带组织复苏后分离和扩增干细胞的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：

1)脐带组织复苏：取出冻存脐带组织的冻存管，放置于37℃水浴中解冻，解冻完毕后，采用复苏缓冲液洗涤3-5次，得到复苏后脐带组织；

2)组织块获得；将步骤1)所得的复苏脐带组织切成1mm³组织块，加入消化液于15℃消化1-2h，然后在37℃消化5-10min,终止消化，移除消化液及悬浮细胞，获取未消化组织块，于氯化钠注射液中漂洗，离心弃上清，得剩余组织块；其中，所述消化液为含有0.5-0.7mg/ml的Ⅱ型胶原酶、0.1-0.2mg/ml的TrypLE express和0.3-0.5mg/ml脯氨酞氨基酸的氯化钠注射液；

3)分离原代干细胞：将剩余组织块放置于培养皿中，相邻剩余组织块之间间隔15-20mm，将培养皿放置于37℃培养箱中静置10min,然后向培养皿中加入培养基，保证剩余组织块能完全浸润在培养基中；每天半数换液，培养2天后，将剩余组织块移入新培养皿，更换培养基，然后继续培养至细胞融合80-90％，收获原代干细胞；

4)扩增传代干细胞：取步骤3)得到的原代干细胞，重悬于培养基中，按照4-5×10⁴个/mL的浓度，在37.0±0.5℃的温度、5.0±0.2％的CO₂浓度和饱和湿度的条件下进行传代培养；

其中所述培养基以DMEM/F12培养基为基础，包含以下浓度组分：10-15mg/ml硒酸钠、20-30μg/ml牛转铁蛋白、85-100μg/ml鸟氨酸、5-7mg/ml植物血凝素、12-18mg/mlα-生育酚琥珀酸单酯、35-40ng/mlIL-6、9-15μg/mlLIF和20-35μg/mlHGF。

2.如权利要求1所述的脐带组织复苏后分离和扩增干细胞的方法，其特征在于，步骤3)中，细胞培养的前2天，向培养基中添加16-22mg/ml亚油酸和5-8μg/ml腺苷脱氨酶。

3.如权利要求1所述的脐带组织复苏后分离和扩增干细胞的方法，其特征在于，步骤4)中，向传代干细胞的培养基中加入10-20mg/ml无水硫酸钙、2-4mg/ml的NAC和100-200ng/mlPDGF-AB。

4.如权利要求1所述的脐带组织复苏后分离和扩增干细胞的方法，其特征在于，其中所述培养基以DMEM/F12培养基为基础，包含以下浓度组分：12mg/ml硒酸钠、24μg/ml牛转铁蛋白、91μg/ml鸟氨酸、6mg/ml植物血凝素、16mg/mlα-生育酚琥珀酸单酯、37ng/mlIL-6、10μg/mlLIF和30μg/mlHGF。

5.如权利要求1所述的脐带组织复苏后分离和扩增干细胞的方法，其特征在于，所述复苏缓冲液为含有15mmol/L蔗糖和0.05％胰蛋白酶的PBS。

6.如权利要求1所述的脐带组织复苏后分离和扩增干细胞的方法，其特征在于，所述步骤3)的原代干细胞培养条件为：37℃、5％CO_2、8％O₂的潮湿空气，PH值保持7.2-7.4。

7.如权利要求1所述的脐带组织复苏后分离和扩增干细胞的方法，其特征在于，步骤3)中所述新培养皿表面包被鼠尾胶。

8.如权利要求7所述的脐带组织复苏后分离和扩增干细胞的方法，其特征在于，所述新培养皿包被鼠尾胶的方法为：采用1.2mg/ml的鼠尾胶去离子水溶液，均匀涂布于培养皿表面，放入37℃、5％CO₂的培养箱中包被1h，吸弃溶液后加入无菌氯化钠注射液冲洗3遍，再加入DMEM/F12培养液冲洗两遍，吹干即得。

9.一种用于脐带组织复苏后干细胞培养的培养基，其特征在于，所述培养基以DMEM/F12培养基为基础，包含以下浓度组分：10-15mg/ml硒酸钠、20-30μg/ml牛转铁蛋白、85-100μg/ml鸟氨酸、5-7mg/ml植物血凝素、12-18mg/mlα-生育酚琥珀酸单酯、35-40ng/mlIL-6、9-15μg/mlLIF和20-35μg/mlHGF。