[发明专利]饲料中沙门氏菌的微滴数字PCR检测方法

说明书

本发明公开了鉴定沙门氏菌的PCR扩增引物及探针引物，包括：沙门氏菌引物正向序列：5＇‑GCGGCGTTGGAGAGTGATA‑3＇，反向序列；5＇‑AGCAATGGAAAAAGCAGGATG‑3＇；探针序列：5＇‑FAM‑CATTTCTTAAACGGCGGTGTCTTTCCCT‑TAMRA‑3＇；一种饲料中沙门氏菌的微滴数字PCR检测方法，包括以下步骤：称取样品至盛有225mL无菌培养液的均质袋中，用拍击式均质器拍打，稀释为1:10的样品匀液，进行增菌培养，得到增菌液；提取待测样品、阳性对照、阴性对照的DNA；获得鉴定沙门氏菌的PCR扩增引物及探针引物；将所得DNA进行微滴数字PCR扩增，获得反应液；对反应液进行检测与分析。结果表明该引物对沙门氏菌的扩增具有特异性；同时微滴数字PCR对其扩增稳定，具有重复性；取浓度为108‑103的基因序列进行检测，灵敏度良好。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及饲料中沙门氏菌的微滴数字PCR检测方法。

背景技术

微滴数字PCR（ddPCR）是近年来发展起来的可以定量检测DNA的新方法，通过PCR扩增和荧光信号的积累读取阳性微滴数目。微滴式数字PCR系统在传统的PCR扩增前对样品进行微滴化处理，即将含有核酸分子的反应体系分成成千上万个纳升级的微滴，其中每个微滴或不含待检核酸靶分子，或者含有一个至数个待检核酸靶分子。经PCR扩增后，逐个对每个微滴进行检测，有荧光信号的微滴判读为1，没有荧光信号的微滴判读为0，根据泊松分布原理及阳性微滴的个数与比例即可得出靶分子的起始拷贝数或浓度。该方法不需要核酸标准品，又兼具qPCR的优势。开发了高灵敏，高选择性的检测饲料中性致病菌的新方法。

沙门氏菌是常见的食源性病原菌。沙门氏菌病是公共卫生学上具有重要意义的人畜共患病之一，其病原沙门氏菌属肠道细菌科，包括那些引起食物中毒，导致胃肠炎、伤寒和副伤寒的细菌。它能引起人和动物很多重大疾病，其广泛存在于自然界中。沙门氏菌传播途径多，比如肉、蛋及食品运输等过程中的感染。肉及其制品的沙门氏菌检出率美国为20%~25%、英国为9.9%、日本检查进口家禽的污染率为10.3%，国内肉类沙门氏菌检出率在1.1%~39.5%；中国蛋及其制品沙门氏菌检出率为3.9%~43.7%，由于吃蛋引起鼠伤寒病的病例报告逐渐有增加的趋势；食品在加工、运输、出售过程中往往被沙门氏菌污染。沙门氏菌在粪便、土壤、食品、水中可生存5个月至2年之久。传统培养法是目前常用检测方法，但其检验沙门氏菌程序复杂，全过程4-7天才能得出明确结果。因此建立一种溯源技术来排查饲料污染，控制饲料安全的关键环节具有重要意义。确定饲料中致病菌在食物链中相关的食品，寻找预防食品污染的关键环节，具备对突发事件的反应能力，建立和完善食源性致病菌及食源性疾病的监测系统和预警系统。微滴数字PCR技术可以弥补食源性病原菌上的应用的不足。

发明内容

本发明目的是为解决传统方法检测沙门氏菌费时、复杂等问题，而提供一种方便、快速的饲料中沙门氏菌的微滴数字PCR检测方法。

饲料中沙门氏菌的微滴数字PCR检测方法，包括以下步骤：

1）称取25g沙门氏菌样品至盛有225mL无菌培养液的均质袋中，用拍击式均质器拍打，稀释为1:10的样品匀液；沙门氏菌样品的增菌培养按照GB 4789.4进行；非目标菌株增菌采用LB培养液在36℃下培养20-30h；获得样品及对照组的增菌液；

2）提取待测样品、阳性对照、阴性对照的DNA；

3）获得鉴定沙门氏菌的PCR扩增引物及探针引物；