[发明专利]饲料中沙门氏菌的微滴数字PCR检测方法

权利要求书

1.饲料中沙门氏菌的微滴数字PCR检测方法，它包括如下步骤：

1）称取25g沙门氏菌样品至盛有225mL无菌培养液的均质袋中，用拍击式均质器拍打，稀释为1:10的样品匀液；沙门氏菌样品的增菌培养按照GB 4789.4进行；非目标菌株增菌采用LB培养液在36℃下培养20-30h；获得样品及对照组的增菌液；

2）提取待测样品、阳性对照、阴性对照的DNA；

3）获得鉴定沙门氏菌的PCR扩增引物及探针引物；

4）将步骤2）所得DNA进行微滴数字PCR扩增，获得反应液；所述的微滴数字PCR反应体系为20μL，各成分含量为：2×ddPCR 预混液10μL，上下游引物（10 µmol/L）各1μL，探针引物（10 µmol/L）1μL，模板DNA 4μL，双蒸水3μL；反应条件为：95℃/5min，1个循环；95℃/15s，60℃/1min，40个循环；98℃/10min（1℃/s），12℃保存反应产物；体系完成后，进行数字PCR反应；

5）对步骤4）的反应液进行检测与分析。

2.根据权利要求1所述的饲料中沙门氏菌的微滴数字PCR检测方法，其特征在于：步骤3）中所述的鉴定沙门氏菌的PCR扩增引物及探针引物，包括：沙门氏菌引物正向序列：5＇-GCGGCGTTGGAGAGTGATA-3＇，反向序列；5＇-AGCAATGGAAAAAGCAGGATG-3＇；探针序列：5＇-FAM-CATTTCTTAAACGGCGGTGTCTTTCCCT-TAMRA-3＇。

3. 根据权利要求1所述的饲料中沙门氏菌的微滴数字PCR检测方法，其特征在于：步骤1）中所述的非目标菌株为：产气荚膜梭菌（ATCC 13124）、粪链球菌（ATCC29212）、金黄色葡萄球菌（ATCC26001）、肠出血性大肠艾希氏菌O157:H7（JL08038）、单核细胞增生李斯特菌（ATCC19111）；培养时间为24h。

4. 根据权利要求2或3所述的饲料中沙门氏菌的微滴数字PCR检测方法，其特征在于：步骤2）中所述的提取，具体包括以下步骤：取增菌液，8000r/min离心5min，弃上清液，加入500μL CTAB、40μL蛋白酶K，震荡均匀，65℃温浴30min；加入500μL三氯甲烷：异戊醇(24∶1)，震荡，12000 r/ min 离心15 min；吸取上层水相至1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，震荡均匀，12000r/min离心10 min；弃上清液，用预热至65℃ TE缓冲液溶解DNA；加入5μLRNA酶溶液，37℃温浴30 min；加入200μL三氯甲烷：异戊醇(24∶1)，震荡，12000r/min离心15min；吸取上层水相至新的1.5mL离心管中，加入等体积的异丙醇，震荡均匀，12000r/min离心10 min；弃上清液，加入70%乙醇洗涤沉淀DNA，12000r/min离心1 min；弃上清液，干燥，加50μL预热至65℃ TE缓冲液溶解DNA。