[发明专利]一种可工业化生产的从尿液中制备人表皮生长因子的方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种从尿液中制备人表皮生长因子的方法，特别涉及一种可工业化生产的从人尿液中提取制备天然人来源的表皮生长因子的方法。

背景技术

人表皮生长因子(Human Epidermal growth factor，hEGF)是1962年美国科学家 Cohen和Montalcini在纯化小鼠颌下腺神经生长因子(NGF)时发现的一种可促进新生小鼠提早开眼、长牙且可促使皮肤细胞生长的成分。它是一种由53个氨基酸残基组成的分子量约为6kDa的小分子单链多肽，等电点(pI)为4.6，含3个链内二硫键。广泛存在于许多组织器官和体液中，作为细胞生长调节因子，有广泛的生物学功能，与个体的生长、发育，细胞的转化、创伤的愈合乃至毛发的生长均有联系。

EGF最明显的作用是促进皮肤和角膜上皮的增殖和分化，这已在整体情况下和离体的组织培养中得到证实。EGF通过与细胞膜上受体结合并激活受体，促进皮肤组织细胞的增殖与生长，加速皮肤新生细胞替代衰老细胞的进程，使皮肤年轻化，对皮肤起到保护作用，从而起到抗衰老和护肤保健等功能。所以，EGF添加于日用护肤品、化妆品中有抗衰老、增加弹性等功能，对受损伤的皮肤，能自动地进行护理，调养和修复。EGF 具体在化妆品中的作用主要表现在护肤、修护，抗皱、防衰老，美白、祛斑，防晒及晒后修复，抑制粉刺和青春痘生长、去除斑痕，护发、养发。正因为EGF对皮肤有显著的生物活性，市场上含EGF的化妆品也日益增多，主要有水剂、啫喱和膏霜等。文献报道添加质量分数为1×10^-6～1×10^-4％的EGF即能起到生物活肤作用。

现在市场上大多是采用的是重组人表皮生长因子(rhEGF)。rhEGF是通过基因工程菌来发酵生产获得人重组表皮生长因子，但是各个工程菌的生产工艺不一样，有些发酵表达的rhEGF构象与天然的hEGF不同，需要复性后才能具有生物活性，而复性比例又很难达到100％，所以只能以比活来评价重组人表皮生长因子的质量，比活性越高则可以认为天然构象的hEGF含量越高，产品的质量就越好。

天然构象的hEGF研究已经非常深入，除了已经解码人体编码hEGF的基因外，对该蛋白的性质、氨基酸组成及结构等也已经测定。正常的人尿液中的EGF的含量约为 17ug/L，hEGF有53个氨基酸组成，分子内有六个半胱氨酸组成的二硫键，形成3个分子内环形结构。而且hEGF没有糖基部位，所以结构相当稳定，耐热耐酸，可以长期稳定保存。发酵生产得到的rhEGF虽然易纯化、产量高，如果未经充分纯化，工程菌中大量存在的蛋白酶往往会残留在产品中，在保存过程中就会降解hEGF，使得hEGF的保质期大大缩短，另外残留在hEGF产品中的菌体蛋白往往能会成为过敏原，造成使用者对hEGF 产品过敏的反应。发酵表达的rhEGF相比天然hEGF其安全性还存在缺陷，因此，目前只能外用。

发明内容

发明目的：为了能够操作方便，成本低，收率高的大规模生产得到不易致敏、更安全可靠、结构稳定、可以长期稳定保存的天然人来源的人表皮生长因子，本发明提供了一种可工业化生产的从尿液中制备人表皮生长因子的方法。

技术方案：本发明所述的可工业化生产的从尿液中制备人表皮生长因子的方法，包括将从人尿中提取的尿蛋白浓缩液依次经金属螯合亲和层析柱、染料亲和层析柱、疏水层析柱、阴离子交换柱、凝胶过滤层析柱层析，得到人表皮生长因子。

所述的尿蛋白浓缩液由以下步骤制备得到：利用阴离子交换树脂作为吸附剂吸附尿液中的尿蛋白，清洗、解吸附、洗脱，将洗脱液进行超滤浓缩，即得尿蛋白浓缩液。

所述的尿蛋白浓缩液由以下更具体的步骤制备得到：将阴离子交换树脂作为吸附剂放置在尿池或尿斗中，吸附流经尿液或稀释尿液中的尿蛋白；收集已吸附尿蛋白的树脂，集中进行清洗、解吸附、洗脱处理，将洗脱液进行超滤浓缩，即得尿蛋白浓缩液，其中含有富集的人表皮生长因子。

所述的解吸附为利用0.5～1.5mol/L的NaCl水溶液进行尿蛋白的解吸附。