[发明专利]一种乙酰氨基葡萄糖偶联物的制备方法及应用

说明书

本发明公开一种式I乙酰氨基葡萄糖偶联物及应用，属于免疫学检测技术领域。本发明的技术方案是把式I结构的乙酰氨基葡萄糖与含‑COOH的载体物质通过脱水缩合反应，形成乙酰氨基葡萄糖偶联物。通过上述方法获得的乙酰氨基葡萄糖偶联物可用于制备抗乙酰氨基葡萄糖抗体，以及应用于免疫方法检测样品中的抗乙酰氨基葡萄糖抗体。用本发明获得的乙酰氨基葡萄糖偶联物制备抗乙酰氨基葡萄糖抗体检测试剂，具有灵敏度高、特异性强、性能稳定等优点。

技术领域

本发明涉及一种式I乙酰氨基葡萄糖偶联物及应用，具体涉及乙酰氨基葡萄糖偶联物结构、制备方法，以及在制备抗乙酰氨基葡萄糖抗体检测试剂中的应用。属于免疫学技术领域。

背景技术

微生物细胞壁多糖在一些自体免疫性疾病的发生发展过程中起重要作用，这些自体免疫性疾病患者的血清中能检测到多种多糖的抗体。其中抗酿酒酵母细胞壁多糖IgA(anti-Saccharomyces cerevisiae immunoglobulin A，ASCA-IgA)和抗酿酒酵母细胞壁多糖IgG (anti-Saccharomyces cerevisiae immunoglobulin G，ASCA-IgG)是被临床广泛认可的克罗恩病的特异性指标。乙酰氨基葡萄糖是酿酒酵母细胞壁多糖的组分之一，不排除克罗恩病特异性指标ASCA中含有乙酰氨基葡萄糖抗原表位。迄今为止，在临床应用的酿酒酵母细胞壁多糖抗原是天然结构的糖蛋白，其中包含了三种不同糖苷键连接的甘露多糖，以及与乙酰氨基葡萄糖以beta-1，4糖苷键连接的乙酰氨基葡萄糖。由于ASCA检测试剂的各厂家原料来源不同，抗原表位的暴露程度不同，质控难度大，检测结果差异显著。为此，以色列科学家发明了用乙酰氨基葡萄糖作为抗原的乙酰氨基葡萄糖二糖anti-chitobiosidecarbohydrate IgA antibodies(ACCA)以及乙酰氨基葡萄糖多聚糖为抗原的anti-chitinIgA antibodies(anti-C)检测试剂。对比文献US2008/0085838A1公布了乙酰氨基葡萄糖寡糖基与固相载体偶联的方法，其是通过活化1号位-OH与固相载体偶联，这种方法的缺陷是无法保证只跟1号位-OH偶联，如果跟其他位的-OH偶联，会影响与抗体结合，对试剂的稳定性造成显著影响，前期研究发现商品化的ACCA。而且1号位的偶联步骤繁琐、效率低下，最终试剂稳定性差。

此外，目前ACCA和anti-C的检测主要是ELISA，该方法检测时间长，不适合门诊快速检测，临床上需要更便捷、快速的检测技术。

发明内容

本发明的目的在于提供一种乙酰氨基葡萄糖偶联物，及其在检测抗乙酰氨基葡萄糖抗体中的应用。

本发明的第一方面，提供一种式I所示乙酰氨基葡萄糖偶联物的结构，其中一个糖基的2 号位-NH2上通过肽键连接载体物质。所述乙酰氨基葡萄糖偶联物比对比文献公布的在1号位偶联具有操作简单、性能稳定、特异性高、不破坏抗原表位等优点。

本发明的第二方面，提供一种乙酰氨基葡萄糖偶联物的制备方法，包括以下步骤：

1)与生物素反应

①取生物素、二环己基碳二亚胺(DCC)和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于DMF中，室温磁力搅拌反应，离心收集上清液；

②取式I乙酰氨基葡萄糖溶于磷酸缓冲液中；

③将①中溶液搅拌下逐滴加入到②所得溶液中，搅拌反应；

④缓冲液透析，得到偶联物。

2)与蛋白质、蛋白质片段、合成多肽或半合成多肽反应

取蛋白质、1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺(EDC)和式I乙酰氨基葡萄糖溶于DMF中，搅拌反应；缓冲液透析，得到偶联物。