[发明专利]骨硬化蛋白单链抗体的制备方法和用途

说明书

骨硬化蛋白单链抗体的制备方法和用途，本发明专利制备方法如下：提取抗SOST单克隆抗体5H3D1杂交瘤细胞总RNA，用RT‑PCR方法扩增抗体轻链可变区基因和重链可变区基因通过重叠延伸拼接PCR方法，在VL和VH基因之间引入Linker3，连接成单链抗体SOST‑scFv。将测序正确的scFv基因克隆至表达载体PET‑22b(+)后转入E.coliBL21进行可溶性表达，聚丙烯酰胺凝胶电泳SDS‑PAGE鉴定表达产物，ELISA和West‑blot检测表达蛋白的反应活性。本发明专利具有分子量小、渗透性高、抗原结合活性高、显著的促进骨生成抑制骨流失的优点。

技术领域

本发明专利属于骨硬化蛋白单链抗体，主要用于骨质疏松和骨质疏松相关骨折的治疗。

背景技术

骨质疏松是以低骨量、骨组织显微结构退化为特点的骨骼系统紊乱，可引起骨脆性和骨折风险增加。目前，骨质疏松已成为一种世界性老年慢性常见病，且骨质疏松相关骨折治疗困难。骨质疏松在中国老年人中的平均患病率约为15.7％，随着年龄的增加患病率还会逐渐上升，2013年底，60岁以上的老年人预计可达2.0243亿，中国需要为骨质疏松承担巨大的财政负担，骨质疏松相关骨折在女性和男性中的发病风险分别是40％、13％。骨质疏松在年龄大于50岁的韩国女性和男性中的患病率分别是34.9％和7.8％，比美国所报道的骨质疏松患病率高3倍，但是，骨质疏松的诊断率只有24.7％，有3/4的骨质疏松病人不知道自己患有骨质疏松，只有10.8％的骨质疏松病人接受治疗，诊断和治疗现状尚不能使人满意。骨质疏松最主要的临床结果是骨折风险增加，骨质疏松所致骨折可产生剧痛、残疾甚至会造成死亡并且产生巨额的经济负担，欧盟27国对骨质疏松流行病学、治疗情况展开调查，结果显示共有女性骨质疏松患者2200万人、男性患者550万人；新发骨质疏松相关骨折350万例，相当于每天9556例新发骨折，造成经济损失370 亿欧元，骨质疏松骨折患者的人数还在不断增加，此次调查结果显示骨质疏松骨折会增加死亡率。巴西绝经后女性骨质疏松的患病率为15％-33％。2016年荷兰发表的一项调查显示，32％的骨折可诊断为骨质疏松骨折，男女患者的比例分别为21％、36％，女性中超过50％的髋骨骨折和脊柱骨折是由骨质疏松引起，到2030 年骨质疏松相关骨折预计增加40％。近年来，椎体成形术(PVP)被广泛应用于骨质疏松相关椎体骨折的治疗，椎体成形术虽安全、有效，但是，PVP后的一个月内很容易发生相邻椎体的压缩骨折。目前，普遍认为骨密度降低、高龄是PVP术后再骨折的主要原因，PVP术后再发椎体骨折是临床亟需解决的难题。Chen 等人研究192例椎体骨折患者，平均年龄74.4岁，行PVP并抗骨质疏松治疗，结果显示，PVP术后临近椎体压缩骨折不可避免，但是在接受抗骨质疏松治疗增加骨密度后可以减少临近未治疗椎体骨折发生率。有症状的脊柱骨折可以增加死亡率高达15％，部分患者因剧痛丧失活动可持续2-3个月，PVP用于急性脊柱骨折患者可减轻患者痛苦，如果骨质疏松的治疗对预防邻近椎体压缩骨折有效，将会降低PVP术后再发骨折风险，对骨质疏松相关脊柱骨折患者产生重大作用。年龄超过50岁之后，大约有1/3的女性和1/5的男性经历过骨质疏松骨折。

促进骨生成和抑制骨吸收是骨质疏松治疗的两种途径，抑制骨吸收虽能改善和维持骨强度，却无法使已经被吸收的骨再生成，通过促进骨生成来治疗骨质疏松，降低相关骨折的发生率，是最好的治疗方式。特立帕肽是最有效的预防非椎体新发骨折的药物，是目前唯一能促进骨生成治疗骨质疏松的药物，但特立帕肽的临床使用存在诸多限制：1.特立帕肽需要患者每天自己注射且需冷冻保存；2.美国限制特立帕肽使用不能超过2年，欧盟建议18-24个月；3.特立帕肽有增加骨肉瘤的风险；4.随着使用时间延长，特立帕肽会逐渐增加骨吸收的程度。目前，通过促进骨生成治疗骨质疏松的合成代谢类药物在临床的应用并不理想。一种人源化的骨硬化蛋白单克隆抗体(AMG785)应用于临床随机对照试验，被证实能有效增加绝经后妇女骨密度，然而骨硬化蛋白单克隆抗体存在分子质量过大、免疫原性强等缺点。

发明内容

本发明提供一种骨硬化蛋白单链抗体的氨基酸序列，SEQ-1