[发明专利]拆分型单碱基基因编辑系统及其应用

说明书

本发明提供了拆分型单碱基基因编辑系统及其应用，具体地，本发明利用spCas9、saCas9蛋白结构信息及其拆分方法，分别发展了内含肽(intein)介导的拆分的BE3(split BE3)、KKH(split KKH)，与未拆分的BE3、KKH工作系统的靶向基因突变效率相当，为可包装进AAV进行递送提供了可能，促进其在基因编辑、基因治疗及临床的广泛应用。

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体地，涉及拆分型单碱基基因编辑系统及其应用。

背景技术

自2013年以来，以CRISPR/Cas9为代表的新一代基因编辑技术进入生物学领域的各个实验，正改变着传统的基因操作手段。

目前，单碱基基因编辑技术，已被报道可用于高效地进行基因组的基因突变或修复，疾病动物模型制作，基因治疗。已发现的单碱基基因编辑工具中，以BE3,KKH的应用最为广泛。但是BE3,KKH全长分别为6.1kb,5.3kb,超出了腺相关病毒(AAV)包装限度4.7kb,导致其无法包装进AAV进行递送达，阻碍了在基因编辑，基因治疗及临床广泛应用。

因此，本领域迫切需要开发可以维持相当的靶向基因突变效率的拆分的单碱基基因编辑系统。

发明内容

本发明的目的在于提供一种可以维持相当的靶向基因突变效率的拆分单碱基基因编辑系统。

本发明的目的在于还提供了拆分的单碱基基因编辑系统(split-BE3和split-KKH)，分别拆分为N端和C端，其长度均小于腺相关病毒(AAV)包装限度4.7Kb,可以用AAV包装并递送，进一步扩大了base editor应用范围。另一方面提供了拆分的单基因基因编辑系统(split-BE3和split-KKH)，可以首先加拆开的base editor的一端，根据需要，在一定时间内加入拆开的base editor的另一端，实现可控性诱导单碱基C到T编辑。

本发明第一方面提供了一种核酸构建物组合，包括第一核酸构建物和第二核酸构建物，其中，所述第一核酸构建物具有从5’-3’的式I结构：

P1-X1-X2-X3-Z-X4 (I)；

其中，P1为第一启动子序列；

X1为胞嘧啶脱氨酶的编码序列；

X2为任选的连接序列；

X3为Cas9核酸酶的N端片段的编码序列或KKH核酸酶的N端片段的编码序列(Cas9n-N或KKH-N)；

Z为第一融合肽N端片段的编码序列；

X4为polyA序列；

所述第二核酸构建物具有从5’-3’的式II结构：

P2-Z-Y1-Y2-Y3 (II)；

其中，P2为第二启动子序列；

Z为第一融合肽C端片段的编码序列；

Y1为Cas9核酸酶的C端片段的编码序列或KKH核酸酶的C端片段的编码序列(Cas9n-C或KKH-C)；

Y2为尿嘧啶糖苷酶抑制剂UGI的编码序列；

Y3为polyA序列；

并且，各“-”独立地为键或核苷酸连接序列。

在另一优选例中，所述的第一启动子和第二启动子各自独立地选自下组：CAG启动子、CMV启动子、或其组合。

在另一优选例中，所述第一启动子序列包括CAG启动子。

在另一优选例中，所述第二启动子序列包括CAG启动子。