[发明专利]一种提高脐带来源间充质干细胞原代细胞产量的制备方法

说明书

本发明涉及细胞培养与细胞分离技术领域，具体公开了一种提高脐带来源间充质干细胞原代细胞产量的制备方法。在传统华通氏胶组织块一次性贴壁培养分离间充质干细胞的基础上，在培养后期不同时间精细地收集华通氏胶组织块并重复贴壁，可在不同的时间连续收集P0代间充质干细胞，该方法通过间充质干细胞不断从华通氏胶组织中游离出生长的特性，使得华通氏胶的利用率实现最大化，与华通氏胶组织块一次性贴壁培养相比，P0代间充质干细胞的获取数量可至少增加2倍，后续通过控制间充质干细胞的培养密度、培养基中血清替代物浓度和培养时间，细胞传代培养至P3代时，所获得细胞数量可完全满足细胞储存和临床移植的需要。

技术领域

本发明涉及细胞培养与细胞分离技术领域，具体地说，涉及一种提高脐带来源间充质干细胞原代细胞产量的制备方法。

背景技术

间充质干细胞(Mesenchymal Stem Cells,MSC)是一类特殊的干细胞，来源于发育早期的中胚层和外胚层，在分类上属于多能干细胞。在体内或体外特定的诱导条件下，MSC可分化为脂肪细胞、骨细胞、软骨细胞、神经细胞、肝细胞、心肌细胞、内皮细胞等多种组织细胞，连续传代培养和冷冻保存后仍具有多向分化潜能，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复，因其具有多向分化潜能的特性，在临床中可广泛用于多种疾病治疗比如肝纤维化、神经损伤、脑瘫、心肌梗死等诸多疑难病症。MSC不表达主要组织相容性复合物(MHC)II类抗原，且不表达或低表达多种移植免疫排斥相关的共刺激因子，如CD80、CD40、CD46、CD40L，是一类免疫缺陷细胞，所以在免疫疾病方面有非常大的治疗优势，可用于移植物抗宿主病(GVHD)，类风湿、红斑狼疮、多发性硬化病等免疫缺陷病，单纯hUCMSC条件培养基具有造血支持功能,并促进CD34⁺细胞向髓系分化，所以在血液疾病方面MSC具有很好的治疗前景，MSC是目前干细胞研究的热点之一。

目前，间充质干细胞的提取研究已较为广泛，最初人们从骨髓中提取MSC，但随着年龄的老化，骨髓中的干细胞数目也会显著降低、增殖分化能力亦大幅度衰退。另外，骨髓MSC移植给异体可能引起免疫反应，且提取干细胞过程对患者的损伤性和在采集时遇到的其他问题，都直接影响了骨髓MSC的临床应用，这使得寻找骨髓以外其他可替代的间充质干细胞来源成为一个重要的问题。后来经过大量深入的研究发现，MSC广泛分布于胎儿和成人的骨膜、松骨质、脂肪、滑膜、骨骼肌、胎肝、乳牙、脐带、脐带血中，其中脐带来源的间充质干细胞(human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells，hUC-MSCs)由于脐带采集过程简单，对产妇及新生儿无任何危害及损伤，脐带间充质干细胞生长环境单一、体外提取方便，使得提取的间充质干细胞纯度高、数量大，且不存在伦理问题，成为骨髓间充质干细胞的理想替代物，具有更广阔的临床应用潜能。

目前，国内外从脐带中分离间充质干细胞的方法主要是对脐带华通氏胶(Wharton′s Jelly)进行酶消化和组织块贴壁两种：酶消化法耗时长，操作过程中所用消化酶对细胞损伤较大，使得分离得到的间充质干细胞活力低、状态差、扩增慢且成本高，故而限制了其临床应用；组织块贴壁法是目前应用比较广泛的一种方法，虽然原代和传代细胞在细胞的获取时间方面相比酶消化法要更长，但因其具有操作简便、细胞损伤小、细胞产量高、成本低廉等优点，因而更合适临床大规模制备与应用。在实际操作过程中，将脐带置于培养皿中，剔除一根脐动脉血管和两根脐静脉血管后，获得脐带华通氏胶。而后，采用组织块贴壁法提取制备间充质干细胞，需要将脐带华通氏胶剪碎成1～3mm³的小组织块，将组织块贴附于培养瓶或培养皿底部，添加培养基后培养几日，间充质干细胞便可从组织块中游离出并在培养容器底部贴壁生长，待间充质干细胞于培养容器底部生长汇合度达85％以上时，用眼科镊将华通氏胶组织块扣除并废弃，所获得细胞即为原代间充质干细胞，可使用消化酶进行消化并传代为第一代，随后，细胞逐代进行消化并扩大培养，最后将获得的间充质干细胞进行冻存。