[发明专利]缢蛏溶菌酶基因、编码蛋白及重组缢蛏溶菌酶基因工程菌的构建方法和应用

说明书

本发明公开了缢蛏溶菌酶基因、编码蛋白及重组缢蛏溶菌酶基因工程菌构建方法和应用，特点是缢蛏溶菌酶基因序列如SEQIDNO.1所示；缢蛏溶菌酶基因编码蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.2所示；其重组缢蛏溶菌酶基因工程菌构建方法为用分别含有BamHI位点和XhoI位点的引物扩增缢蛏溶菌酶基因编码蛋白的成熟肽序列；将克隆得到的目的基因插入pET28a（+）载体，获得重组质粒pET28a（+）‑Lysozyme；对重组质粒pET28a（+）‑Lysozyme进行诱导表达，获得重组缢蛏溶菌酶基因工程菌，优点是其表达的重组缢蛏溶菌酶基因工程菌对哈维氏弧菌，副溶血弧菌，灿烂弧菌均具有明显的杀菌作用。

技术领域

本发明属于分子生物学以及基因工程技术领域，尤其是涉及一种缢蛏溶菌酶基因、编码蛋白及重组缢蛏溶菌酶基因工程菌的构建方法和应用。

背景技术

溶菌酶（Lysozyme，EC 3.2.1.17）是一种具有水解粘多糖功能的碱性酶，它能催化细菌细胞壁中粘多糖N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡萄糖之间的β-1，4糖苷键的水解，进而破坏细菌细胞壁肽聚糖支架、导致内容物逸出，从而引起细菌死亡。溶菌酶作为一种广谱抗菌效应分子，广泛存在于各种微生物、植物、无脊椎动物和脊椎动物中，并在生物机体的免疫防御系统中发挥重要作用。在无脊椎动物组织中分布最为广泛的抗菌蛋白即是溶菌酶，这对只有先天免疫的无脊椎动物而言，溶菌酶的抗菌效应更为重要。在无脊椎动物中，溶菌酶还具有消化酶的作用，其通过分解微生物来获得生长所需的部分碳源和氮源。随着研究的深入，研究者发现溶菌酶除抗菌活性外，还具有许多其它功能，包括抗病毒、抗炎、抗肿瘤活性，以及诱导调节机体其他免疫因子的合成与分泌、协同其它免疫因子进行免疫防御调节作用。

溶菌酶独特的作用机制和广泛的抗菌作用，使其在临床研究及大规模的市场应用上受到了越来越广泛的关注。在医学上，溶菌酶可以作为多种疾病的标志物，通过测定尿液、分泌物、血清或组织中溶菌酶的浓度和活性变化，作为诊断的指标之一。根据溶菌酶能溶菌，但对组织无刺激、无毒性的特性，己广泛应用于食品、医药、化工、生物工程等领域。目前，人们对动物性食品安全的要求越来越高，溶菌酶作为天然、安全的抗菌物质也越来越广泛的应用于畜禽及水产动物饲料中。随着对水产动物免疫抗病机制研究的不断深入，将重组溶菌酶作为绿色制剂应用到水产养殖中有望成为水产动物健康养殖的一条新途径。

缢蛏（Sinonovacula constricta）作为我国四大养殖贝类之一，在水产养殖中占据了重要的经济地位。然而，随着沿海城市经济的发展，海洋污染日益加剧，导致养殖缢蛏病害问题时有发生，尤其是细菌性疾病引发的疾病严重制约了缢蛏的生存和生长。目前在缢蛏养殖中大多使用抗生素进行防治，但抗生素的大量使用导致了“超级细菌”的出现以及抗生素的残留引起的食品安全问题日益突出，人们迫切需要开发新型抗菌剂进行防治。溶菌酶作为一种天然杀菌蛋白，不会导致细菌耐药性问题、而且对人体无毒害作用。因此，构建缢蛏溶菌酶基因表达工程菌，进而产业化制备绿色疾病制剂应用于水产养殖迫在眉睫。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种缢蛏溶菌酶基因、编码蛋白及重组缢蛏溶菌酶基因工程菌的构建方法和应用，其表达的重组缢蛏溶菌酶基因工程菌对哈维氏弧菌，副溶血弧菌，灿烂弧菌均具有明显的杀菌作用。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

1、一种缢蛏溶菌酶基因，该基因具有SEQIDNO.1所示的cDNA序列。该序列全长768bp，包括423 bp的开放阅读框，编码140个氨基酸，5’非编码区长168 bp，3’非编码区长177bp，具有多聚腺苷酸信号(AATAAA)及序列末端含有典型的polyA尾。

所述的缢蛏溶菌酶基因的克隆方法，具体步骤如下：

a．总RNA提取：取缢蛏鳃组织制备得到RNA提取液；