[发明专利]缢蛏溶菌酶基因、编码蛋白及重组缢蛏溶菌酶基因工程菌的构建方法和应用

权利要求书

1.一种缢蛏溶菌酶基因，其特征在于该基因为SEQ ID NO.1所示的cDNA序列。

2.一种权利要求1所述的缢蛏溶菌酶基因的克隆方法，其特征在于具体步骤如下：

a.总RNA提取：取缢蛏鳃组织制备得到RNA提取液；

b.cDNA第一链合成：将RNA提取液用cDNA合成试剂盒逆转录合成cDNA；

c.PCR扩增：cDNA 1.0μL，含Mg²⁺的10×PCR缓冲液2.5μL，浓度2.5mM的dNTP 2.0μL，浓度10μM的Lysozyme上游扩增引物1.0μL，浓度10μM的Lysozyme下游扩增引物1.0μL，浓度5U/μL的DNA聚合酶0.2μL，超纯水17.3μL；扩增条件：94℃5min、94℃30s、60℃30s、72℃1min，共35个循环，最后72℃延伸10min；其中Lysozyme上游扩增引物：

ATGCTCCTTTACGCTGTGGTCAT，Lysozyme下游扩增引物：

CTAATGGACATTAGAACATCCTG；

d.PCR阳性克隆质粒：扩增反应后，用胶回收试剂盒回收PCR产物，然后回收产物与载体pMD19-T连接，转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α后，在含有氨苄浓度为50μg/mL的LB平板培养基中培养8-12h，挑取阳性克隆菌落，进行PCR验证，并送至上海生工生物工程有限公司测序鉴定，得到正确的PCR阳性克隆质粒，即缢蛏溶菌酶基因，该基因具有SEQ ID NO.1所示的cDNA序列。

3.一种根据权利要求1所述的缢蛏溶菌酶基因编码蛋白，其特征在于：该编码蛋白为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求3所述的缢蛏溶菌酶基因编码蛋白，其特征在于：该编码蛋白的成熟肽为SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。

5.一种利用权利要求4所述的缢蛏溶菌酶基因编码蛋白构建重组缢蛏溶菌酶基因工程菌的方法，其特征在于步骤如下：

(1)设计PCR引物，用分别含有BamHI位点和XhoI位点的引物扩增缢蛏溶菌酶基因编码蛋白的基因；

(2)将克隆得到的目的基因插入pET28a(+)载体，获得重组质粒pET28a(+)-Lysozyme；

(3)对重组质粒pET28a(+)-Lysozyme进行诱导表达，获得重组缢蛏溶菌酶基因工程菌。