[发明专利]缢蛏I型溶菌酶-2基因、编码蛋白及重组缢蛏I型溶菌酶-2基因工程菌的构建方法

说明书

本发明公开了缢蛏I型溶菌酶‑2基因、编码蛋白及重组缢蛏I型溶菌酶‑2基因工程菌构建方法和应用，特点是缢蛏I型溶菌酶‑2基因序列如SEQIDNO.1所示；其克隆方法为根据与缢蛏I型溶菌酶‑2基因同源的表达序列标签EST序列设计3’RACE的巢式引物，采用3’RACE技术扩增基因全长；缢蛏I型溶菌酶‑2基因编码蛋白氨基酸序列如SEQIDNO.2所示，用分别含有BamHI位点和XhoI位点的引物扩增缢蛏I型溶菌酶‑2蛋白；将克隆得到的目的基因插入载体获得重组质粒，对重组质粒进行诱导表达，再进行纯化即获得基因工程菌，优点是对哈维氏弧菌，副溶血弧菌和灿烂弧菌具有抑制作用。

技术领域

本发明属于分子生物学以及基因工程领域，尤其是涉及一种缢蛏I型溶菌酶-2基因、编码蛋白及重组缢蛏I型溶菌酶-2基因工程菌的构建方法和应用。

背景技术

抗菌肽/蛋白是一类广泛存在于整个生物界中的双亲性小分子碱性多肽，是机体先天免疫的关键因子。Steiner最早在天蚕中发现后，到目前为止，在各种生物中总共发现了1000多种抗菌肽。根据抗菌肽的序列、二级结构和抗菌特性等，将已发现的抗菌肽分为四大类：（1）不含半胱氨酸的线型抗菌肽，如天蚕素、马盖宁等；（2）具有半胱氨酸的环型抗菌肽，如防御素，抗真菌肽等；（3）富含某一种或两种氨基酸的抗菌肽，主要包括富含脯氨酸的抗菌肽以及富含甘氨酸的抗菌肽等；（4）由前体大分子酶解产生的抗菌肽，如肢口纲中鲎的血蓝蛋白。

不同类型的抗菌肽的作用机理与传统抗生素不同，它的靶位点主要是病原体细胞膜，因此不易产生抗性，并且抗菌肽对真核细胞几乎没有毒副作用，仅仅作用于原核细胞和发生病变的真核细胞。抗菌肽不仅作用于革兰氏阳性菌及革兰氏阴性菌，而且也作用于真菌、原虫、某些病毒和肿瘤细胞，同时，还能加速免疫和伤口愈合过程。由于病原菌对抗生素逐步产生抗药性，抗菌肽为开发新的抗细菌、抗真菌、抗病毒和抗肿瘤药物开辟了广阔的前景。国外目前已有4种抗菌肽药物进入三期临床，2种进入二期临床测试。此外，把抗菌肽基因导入植物体，使之整合到染色体基因组上，产生抗病的植物体已取得可喜进展。因此，抗菌肽的研究不仅在理论上具有重要意义，而且在实践上具有巨大的潜力。

溶菌酶作为一种具有广谱性的抗菌活性的功能多肽/蛋白，在临床研究及大规模的市场应用上受到了越来越广泛的关注。在医学上，溶菌酶可以作为多种疾病的标志物，通过测定尿液、分泌物、血清或组织中溶菌酶的浓度和活性变化，作为诊断的指标之一。根据溶菌酶能溶菌，但对组织无刺激、无毒性的特性，己广泛应用于食品、医药、化工、生物工程等领域。缢蛏（Sinonovacula constricta）作为我国四大养殖贝类之一，在水产养殖中占据了重要的经济地位。然而，随着沿海城市经济的发展，海洋污染日益加剧，导致养殖缢蛏病害问题时有发生，尤其是细菌性疾病引发的疾病严重制约了缢蛏的生存和生长。目前在缢蛏养殖中大多使用抗生素进行防治，但抗生素的大量使用导致了“超级细菌”的出现以及抗生素的残留引起的食品安全问题日益突出，人们迫切需要开发新型抗菌剂进行防治。溶菌酶作为一种天然杀菌蛋白，不会导致细菌耐药性问题、而且对人体无毒害作用。因此，构建缢蛏溶菌酶基因表达工程菌，进而产业化制备绿色疾病制剂应用于水产养殖迫在眉睫。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种缢蛏I型溶菌酶-2基因、编码蛋白及重组缢蛏I型溶菌酶-2基因工程菌的构建方法和应用，其表达的重组蛋白对革兰氏阴性菌灿烂弧菌、哈维氏弧菌、副溶血弧菌具有较强的抑菌活性。

本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为：

1、一种缢蛏I型溶菌酶-2基因，该基因具有SEQID NO.1所示的基因序列。该序列全长1558 bp，包括426 bp的开放阅读框，编码141个氨基酸，5’非编码区长375 bp，3’非编码区长757 bp， 具有多聚腺苷酸信号，序列末端含有典型的poly A尾。