[发明专利]缢蛏I型溶菌酶-2基因、编码蛋白及重组缢蛏I型溶菌酶-2基因工程菌的构建方法

权利要求书

1.一种缢蛏I型溶菌酶-2基因，其特征在于：该基因为SEQ ID NO.1所示的基因序列。

2.一种权利要求1所述的缢蛏I型溶菌酶-2基因的克隆方法，其特征在于：根据与I型溶菌酶-2基因同源的表达序列标签EST序列设计RACE的巢式引物，采用RACE技术扩增基因全长，具体步骤如下：

(1)通过对副溶血弧菌感染的缢蛏肝胰腺组织高通量转录组测序，发现了1条编码I型溶菌酶基因的EST序列，以此EST序列片段进行基因全长克隆；

(2)RACE引物设计：根据编码缢蛏I型溶菌酶-2基因的部分片段的EST克隆设计3’RACE的巢式引物：3’上游特异性扩增引物1：

CAGTTTCCTCCCGGACCTGTTGA，3’上游特异性扩增引物2：

GCCAGACGTACGCTAGGGAACAC，扩增3’接头引物Adaptor3：

GGCCACGCGTCGACTAGTACTT；

(3)3’RACE扩增获取缢蛏I型溶菌酶-2基因全长序列，具体步骤如下：

a.总RNA提取：取缢蛏的肝胰腺组织制备得到RNA提取液；

b.3’-RACE扩增：将上述RNA提取液用3’-Full RACE Core Set withPrimeScript^TMRTase试剂盒逆转录合成扩增3’的模板，以此为模板，使用3’上游特异性引物1和扩增3’接头引物进行PCR扩增，取稀释后PCR产物作为模板，再用3’上游特异性引物2和扩增3’接头引物进行PCR扩增，得到3’端目的条带；

c.将扩增产物3’端目的条带使用凝胶回收试剂盒回收，回收产物与载体pMD19-T连接，转化至大肠杆菌Escherichia coli DH5α后，在含有氨苄浓度为50μg/mL的LB平板培养基中培养8-12h，挑取阳性克隆菌落，进行PCR验证并送至上海华大基因生物工程有限公司测序，所得结果经DNAMAN软件分析拼接得到缢蛏I型溶菌酶-2基因全长序列，其基因序列如SEQID NO.1所示。

3.一种权利要求1或2所述的缢蛏I型溶菌酶-2基因编码蛋白，其特征在于：该编码蛋白为SEQ ID NO.2所示的氨基酸序列。

4.根据权利要求3所述的一种缢蛏I型溶菌酶-2基因编码蛋白，其特征在于：该编码蛋白的成熟肽为SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列。