[发明专利]一个插入内含子修饰的大豆氨基酸转运蛋白融合基因及其应用

说明书

一个插入内含子修饰的大豆氨基酸转运蛋白基因及其应用。本发明在一个农杆菌致死的大豆氨基酸转运蛋白编码序列中插入一段内含子序列，人工拼接成一个融合基因，命名为NKNUE1，序列如SEQ ID No.1所示。NKNUE1可在植物细胞中正常表达，经内含子剪切后翻译成广谱氨基酸转运蛋白；而农杆菌中缺乏相应内含子剪切机制，由此实现利用农杆菌介导的遗传转化获得NKNUE1转基因植物的目的。可以构建由35S启动子或其他启动子驱动NKNUE1表达载体并转化目标植物。本发明提供两个实施例，证明NKNUE1显著增强转基因大豆等对氨基酸的吸收和由源向库输送能力、低氮抗性增强、种子中总氮和重要氨基酸含量显著增加。

【技术领域】：

本发明属于植物基因工程领域，具体说是用分子生物学技术获得一个插入内含子修饰的大豆氨基酸转运蛋白编码基因及其在转基因植物/作物新品种培育中的应用。

【背景技术】：

氮素是植物生长所必需的重要元素之一，氮素的供应直接影响着农作物的品质和产量。氮肥是作物氮素供应的直接来源，然而氮肥的过度施用不仅对作物产量的贡献极为有限，还会产生能源浪费和环境污染等诸多问题(巨晓棠等，2014a，2014b)。因此，提高植物对氮素的利用效率(nitrogen use efficiency，NUE)对农业的可持续发展有着重要意义。培育高效利用氮素营养的作物品种的途径包括利用经典遗传学方法选育优异的营养高效品种和利用现代分子生物学方法培育转基因新材料。传统选育方法周期长，见效慢；相比之下，转基因技术更直接而快速。因此，利用基因工程技术，改造农作物对土壤中养分的吸收和转运能力以及利用效率已经成为新世纪国际上农业科学研究的焦点课题。

植物对氮素的利用通过吸收、同化、转运和再动员几个步骤来完成(Masclaux-Daubresse等，2010)。土壤中的氨基酸可以直接被植物根系吸收，同时，对大多数植物来讲，氨基酸还是其氮素转运的主要形式(Tegeder，2014)。植物中吸收、合成或源器官中大分子降解所产生的氨基酸，其跨膜运输是由氨基酸转运蛋白来完成的。氨基酸转运蛋白是一类膜蛋白，在真菌、动物和植物的细胞及细胞器之间的氨基酸运输过程中发挥重要的功能(Wipf等，2002)。植物中的氨基酸转运蛋白在植物根部从土壤中吸收的氨基酸、根部吸收和合成的氨基酸向生长的“库”的长距离运输、氮素再动员中“源”器官中氨基酸的韧皮部装载、种子发育过程中氨基酸输入等过程中均发挥着重要的功能(Hirner等，1998，2006；Hammes等，2006；Tegeder，2014；Lee等，2007；Sanders等，2009；Zhang等，2010)。

研究表明，高表达部分氨基酸转运蛋白编码基因可以赋予转基因植物更好的生长发育状态和产量相关性状。在拟南芥中过表达AtLHT1可以增强转基因植物对多种氨基酸的吸收功能，同时增加转基因植物的生物量的积累(Hinier等，2006)；在豌豆中表达菜豆的AAP1基因显著提高了转基因豌豆种子中总氮和蛋白质的含量，增加了种子的重量(Rolletschek等，2005)；在番茄果实中过表达SlCAT9可以改善果实中氨基酸的组成(Snowden等，2015)。由此可以看出，对氨基酸转运蛋白基因表达水平的调控对作物产量和品质的改善和提高具有重要意义。

大豆是全世界范围广泛栽培的主要农作物之一，也是我国重要的油料作物和高蛋白粮饲兼用作物，同时又是我国供需矛盾最为突出的农产品。大豆是需肥较多的作物，其生长所需的氮素只有三分之一来自固氮，另外三分之二要来自土壤和肥料。氮素既是提高大豆植株光合效率的保障，又是种子干物质积累和成熟的限制因子之一，因此，分离大豆中氨基酸转运蛋白编码基因用于作物氮素利用能力的提高和产量性状的改善具有重要的应用价值，但是目前尚无相关的研究报道。

【发明内容】：