[发明专利]一个插入内含子修饰的大豆氨基酸转运蛋白融合基因及其应用

权利要求书

1.一个插入内含子修饰的大豆氨基酸转运蛋白融合基因NKNUE1，其核酸序列选自：

(a)如序列表1所示的核酸序列；

(b)在(a)限定的核酸序列中至少具有85％以上的同源性的核酸序列。

2.构建权利要求1所述的融合基因NKNUE1的引物，其特征在于，设计用于融合基因NKNUE1创制的引物4条，具体引物序列如下，其中引物1中引入了Apa I酶切位点；引物4中引入了Spe I酶切位点：

引物1：5’-GGGCCCAGGATCCATGGGAAGCATGCACATAGAAACC-3’

引物2：5’-TCGCTTGCCATGTACAGGGTCA-3’

引物3：5’-TGACCCTGTACATGGCAAGCGA-3’

引物4：5’-ATACAAGCCCTTCCAAGCAGAACAACTCGAGGTACTAGT-3’。

3.构建权利要求1所述的融合基因NKNUE1的方法，其特征在于，具体操作步骤如下：

(1)利用权利要求2设计的引物1和引物2，以大豆基因组DNA为模板，用PCR扩增方法获得片段A；利用权利要求2设计的引物3和引物4，以大豆cDNA为模板，用PCR扩增方法获得片段B；

(2)分别回收A、B片段的PCR扩增产物；

(3)取(2)步回收的等量的A、B片段进行融合PCR；

(4)回收融合PCR产物；

(5)将上述(4)步回收的扩增产物，与pMD-18T载体在连接酶催化下进行连接反应；

(6)将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞；

(7)通过抗性筛选，获得该融合基因NKNUE1的阳性TA克隆。

4.一种权利要求1所述的插入内含子修饰的大豆氨基酸转运蛋白的融合基因NKNUE1的应用，其特征在于，利用获得的融合基因NKNUE1，构建获得由CaMV35S启动子或其他启动子驱动该融合基因表达的双元表达载体，进行受体植物的遗传转化，从而获得基因组中含有可在受体植物中组成型或特异性高表达含有以上所述核酸序列基因的转基因植株。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将CaMV35S启动子驱动所述融合基因NKNUE1表达的双元表达载体转化模式植物拟南芥，获得了低氮耐受性提高的转基因拟南芥。

6.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，将CaMV35S启动子驱动所述融合基因NKNUE1表达的双元表达载体转化大豆，获得了该融合基因高表达的转基因大豆，这些转基因大豆植株中氨基酸的吸收和由“源”向“库”的运输能力增强，对低氮胁迫的耐受性得到显著提高，而且无论足氮还是低氮培养条件下，高表达NKNUE1的转基因大豆种子中总氮和多种游离氨基酸的含量都明显提高，种子品质得到改善。