[发明专利]环介导恒温扩增法检测苎麻疫霉菌的引物及其检测方法

说明书

技术领域

本发明属于农作物病害检测、鉴定及防治技术领域，具体涉及环介导恒温扩增法检测苎麻疫霉菌的引物及其检测方法，可用于苎麻疫霉菌快速、灵敏和特异的分子检测，同时可用于苎麻疫霉菌所引起病害的早期诊断和病菌的监测和鉴定。

背景技术

棉花、苎麻均是我国重要的经济作物。中国是世界上主要棉花生产国和消费国，棉花产业发展直接关系到广大农民的利益，关系到纺织工业的发展，对中国国民经济影响较大，对世界经济发展也有重要意义；苎麻是我国传统特产，中国苎麻种植面积和产量均占世界之首，加工规模和出口量在国际市场上占支配地位。在棉花和苎麻种植过程中要经受多种病虫害危害，其中由苎麻疫霉菌Phytophthora boehmeriae Sawada侵染引致的棉花、苎麻疫病对棉花和苎麻威胁极大，该病原菌常导致棉花烂铃、死苗，苎麻叶斑、茎腐，是严重影响棉花和苎麻产量和品质的关键因素之一。因此建立苎麻疫霉菌快速分子检测、鉴定技术研究，开展其引起疫病的早期检测，对于防止棉花、苎麻疫病的扩散、蔓延和减少经济损失具有重要意义。

疫霉菌传统的检测鉴定方法主要通过对分离物形态学特征、生物学、致病性和生理生化特征指标作为依据，对照已有的研究资料确定其分类地位。但由于疫霉属卵菌形态变异大，一些用于分类、鉴定的形态学特征易受人为因素和环境条件影响，具有很大的不稳定性，特别是分离物不典型或不产孢时，使得鉴定工作更加困难。因此，传统检测鉴定方法不仅存在着检测所需时间太长、程序繁琐、灵敏度低和经验性强等不足，而且还存在着难以从发病初期的植株中分离鉴定出病原菌，难以对病害的早期做出准确诊断，也难以给病害防治提供有效防治时期等缺点。

近年来，随着分子生物学技术在植物病理学中的不断发展，特别是PCR技术及相关分子标记技术已广泛地应用于疫霉菌的检测鉴定中，使得疫霉菌的检测鉴定技术取得了长足的进步。相对传统生物学方法，PCR检测技术具有特异性强、灵敏度高、可重复性强、受外界因素影响较小等优点，但其检测需要昂贵精密的PCR仪等仪器设备，且检测过程繁杂、对操作人员的熟练度和专业技术水平要求比较高，且耗时较长，不利于在基层推广，而且植物病害防控的关键在于对病原微生物的快速、准确和及早的检测并确诊。因此很有必要开发一种简便易行、可以快速、准确检测疫霉菌的方法。

日本科学家Notomi等于2000年研发了一种名为环介导恒温扩增(Loop-mediated isothermal amplification, LAMP)的核酸体外扩增技术。该技术主要采用能够识别靶标基因保守DNA序列中的6个特异性位点的4条引物，利用一种链置换Bst DNA聚合酶在60-65℃恒温条件下进行大量扩增目标DNA反应。LAMP反应产物可以通过浊度仪、凝胶电泳仪和肉眼识别进行检测，该方法具有操作简单、特异性高、成本低、快速、高效和经济等优点，已广泛被应用于疫霉菌的分子检测鉴定中。国内外尚未见LAMP方法检测苎麻疫霉菌的报道。本发明根据苎麻疫霉菌ITS保守序列设计特异性引物，优化反应体系，建立了快速、灵敏和可视化的LAMP检测体系，为苎麻疫霉菌的检测鉴定提供理论基础和技术方法。

发明内容

本发明的目的是提供环介导恒温扩增法检测苎麻疫霉菌的引物及其检测方法， 针对现有技术中对苎麻疫霉菌检测和鉴定主要基于形态学特征，方法耗时长、程序繁琐、经验性强、准确度低，难以做到对病害发生的及时监测和控制病原菌的传播、流行的问题，以及现有PCR分子检测需要依靠扩增仪等贵重仪器，且检测时间较长等问题，提供了苎麻疫霉菌的分子检测方法，对苎麻疫霉菌进行LAMP检测，检测周期短、准确性高、灵敏性高、肉眼观察检测结果。

实现本发明的目的包括下列步骤（技术方案）：

1. 苎麻疫霉菌LAMP检测特异性引物的设计：