[发明专利]环介导恒温扩增法检测苎麻疫霉菌的引物及其检测方法

权利要求书

1. 环介导恒温扩增法检测苎麻疫霉菌的引物，其特征在于，所述的引物由F3、B3、FIP和BIP 4条特异性引物组成，其核苷酸序列分别为：F3:5’- TTCCTTCCGTGTAGTCGGT -3’，B3: 5’- CCGAAACCAACACTACCGC -3’，FIP: 5’- ATTTCAAAGGACTCGCCGCCG-GGGAATGCCAGACGTGAAG -3’，BIP: 5’- ATGTATGTTGTGGAGGCTGCCA-CCTCTCCAAAACGCCTCAG - 3’。

2.利用权利要求1所述引物建立的苎麻疫霉菌环介导等温扩增检测的方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）待测样品中基因组DNA的提取：用CTAB方法或DNA提取试剂盒提取待测样品中DNA；

（2）LAMP恒温扩增：以步骤（1）提取的DNA为模板，在PCR管中配制25μL反应体系，包括5 μM引物F3和B3各1.0 μL，40 μM引物FIP和BIP各1.0 μL，LAMP反应混合液12.5μL，8 U Bst聚合酶1.0 μL，模板DNA 1.0 μL，用灭菌超纯水补足至25μL，将配制好的PCR管置于63℃水浴锅中恒温反应60min；

（3）LAMP扩增结果的判断：待LAMP反应结束后，在反应产物中加入1μL SYBR Green I荧光显色剂轻轻混匀，静置5min进行显色观察，在常光下反应显现绿色，则待测样品中含有苎麻疫霉菌，反应显现橙色，则待测样品中不含有苎麻疫霉菌，在紫外光下若观察到浑浊状沉淀则样品中含有苎麻疫霉菌，澄清透明则样品中不含有苎麻疫霉菌。

3. 根据权利要求2所述的苎麻疫霉菌环介导恒温扩增检测的方法，其特征在于，LAMP反应混合液由如下成分组成：40 mM Tris-HCl，20 mM (NH₄)₂SO₄，20 mM KCl，16 mM MgSO₄，1.6 mol/L甜菜碱，2.0 mM dNTPs，0.2wt.% Trion X-100。

4.如权利要求1所述引物在检测苎麻疫霉菌中的应用。