[发明专利]昆虫细胞表达sST2做为测定血清中sST2浓度的校准品

说明书

本发明属于生物技术领域。公开了用昆虫细胞表达可溶性生长刺激表达蛋白2做为ELISA测定血清中sST2浓度的校准品过程，此方法步骤如下：提取T47D细胞RNA,用于合成cDNA，用PCR扩增出sST2DNA；用sST2 DNA构成pFastBac‑Flag‑sST2载体，再转导入HD10Bac细菌株，产生重组Flag‑sST2昆虫病毒质粒；把Flag‑sST2AcNPV质粒DNA转导进昆虫细胞，产生重组Flag‑sSt2AcNPV；用Flag‑sST2 AcNPV感染SF9细胞，表达出Flag‑sST2蛋白，用Anti‑Flag M2 affinity agarose纯化出具有自然结构和抗原性Flag‑sST2；用Flag‑sST2作为校准品，建立双夹心酶联免疫法，测定血清或其它液体中sST2浓度,此发明制备出具有蛋白自然结构和抗原性Flag‑sST2，做为测定液体中sST2浓度的校准品，用于临床检测血清中sST2浓度。

技术领域

本发明属于生物技术领域。

背景技术

可溶性生长刺激表达蛋白2(Soluble suppression of tumorigenicity 2 ，sST2)属于白介素-1受体家族成员。ST2基因表达于肥大细胞、辅助性Ｔ细胞２（Ｔｈ２）、成纤维细胞、心肌细胞等。在人体内ST2基因编码3种亚型蛋白质, 一是在人肠组织中表达的ST2V。二是膜结合型受体蛋白ST2L，由细胞膜外3个串联的免疫球蛋白结构域、跨膜结构域和细胞内的TIR(Toll/Interleukin-lreceptor)结构域三部分组成。ST2L 选择性表达在Th2淋巴细胞表面，可作为 Th2细胞表面标记分子。ST2L可与细胞外配体分子白介素-33(IL-33)及细胞膜上的白介素-1受体辅助蛋白形成复合物，激活细胞内多条信号通路，促进Th2相关的炎症因子（IL-4, IL-5, IL-13）表达，参与多种免疫相关疾病的调控过程。ST2基因编码第三种蛋白为sST2，与ST2L比较，sST2缺少ST2L跨膜结构域和胞内结构域，在C-末端存在5个不同的氨基酸片段，为分泌性，可溶型蛋白（sST2），分泌到细胞外血液中，sST2在心力衰竭发生和发展过程中起重要作用。

研究表明，IL-33通过与心肌细胞膜ST2L结合，具有抗心肌细胞肥大、抗心肌纤维化等作用。当心肌肥大和衰竭时，心肌成纤维细胞和血管内皮细胞，在受到机械牵拉刺激后，释放出IL-33增多；与此同时，血管内皮细胞，成纤维细胞和心肌细胞也释放更多sST2到血液中。sST2可作为诱骗受体，能够竞争性结合血液中游离IL-33，从而抑制血液中IL-33结合到心肌细胞膜上ST2L受体，削弱IL-33 抗心肌肥大和纤维化作用，加重心力衰竭。由此看出，血液中sST2浓度增高代表心力衰竭发生。

测定病人血清中sST2浓度，作为心力衰竭新型标志物，用于判定心力衰竭的发生和愈后。需要开发出测定血清中sST2浓度的免疫学方法试剂盒，同时需要纯化sST2做为试剂盒的校准品。

发明内容

本发明的目的采用昆虫细胞系统表达sST2，可用于诊断心力衰竭昆虫细胞表达sST2做为测定血清中sST2浓度的校准品。

本发明步骤是：

a、提取T47D RNA，合成T47D cDNA基因库，用PCR扩增出sST2 DNA，核酸序列55-987，构建pFastBac-Flag-sST2载体；

b、pFastBac-Flag-sST2载体 DNA 转导到HD10Bac 细菌中，产生重组Flag-sST2AcNPV 质粒；

c、重组Flag-sST2 AcNPV质粒DNA 转导进到SF9细胞，产生重组Flag-sST2 AcNPV；

d、重组Flag-sST2 AcNPV感染SF9细胞并表达出带有8个氨基酸残基-----DYKDDDDK，短肽Flag，sST2-----19-328氨基酸残基的Flag-sST2蛋白；